Јади Чудинов, В.А. Платонов, А.В. Александрова, С.Н. Елански
Неодамна се покажа дека аскомицетската габа Ilyonectria crassa е способна да зарази клубени од компири. Оваа работа е прва што ги анализира биолошките карактеристики и отпорноста на некои фунгициди на сојот I. crassa изолиран од компири. Редоследот на специфичните видови на региони на сојот „компир“ се совпадна со оние добиени порано за габите изолирани од корените на нарциси, женшен, јасика и бука, луковици од лилјани и лисја од лале. Очигледно, многу диви и градинарски растенија можат да бидат резерви на I. crassa. Истражениот вид инфицирал парчиња домати и компири, но не го заразил целото овошје од домати и непроменетиот клубен од компир. Ова покажува дека I. crassa е паразит на рани. Проценка на отпорност на флудиоксонил, дифеноконазол и азоксистробин на хранлив медиум покажа висока ефикасност на овие лекови.
Индикаторот EC50 (концентрација на фунгицид, кој забавува за 2 пати поголема од стапката на радијален раст на колонијата во однос на нефунгицидната контрола) беше еднаков на 0.4; 7.4 и 4 mg / l, соодветно. Можноста за развој на болеста предизвикана од I. crassa треба да се земе предвид при фитопатолошка проценка на клубени од компир и развој на мерки за заштита на растенијата.
Развојот на фитопатогени микроорганизми доведува до големи загуби во сите фази на одгледување и чување компири. При планирање на заштитни мерки, по правило, се земаат предвид добро познати патогени микроорганизми, како што се видови на родови Алтернарија, Фузариум, Фома, Хелминтоспориум, Колетотрихум, Фитофтора итн. Сепак, во последниве години, се појавуваат се повеќе извештаи за појава на нови фитопатогени микроорганизми на компирот. Нивната биологија е слабо проучена, ефективноста на фунгицидите што се користат на компирот е непозната, дијагностичките методи не се развиени. Со масивен развој, тие се способни да предизвикаат значителна штета на културата на компирот. Еден од овие микроорганизми е аскомицетската габа Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Кабрал и Крус, за прв пат откриена од авторите на клубени од компири (Чудинова и сор., 2019).
Оваа работа ги претставува резултатите од анализата на вирусот I. crassa изолиран од клубени од компир. Проучена е морфологијата на колониите и мицелијалните структури на I. crassa, нуклеотидните низи на ДНК-региони специфични за видовите, вирулентноста кон компирот и доматите и отпорноста на некои популарни фунгициди.
материјали и методи
Ние го искористивме видот I. crassa 18KSuPT2 изолиран во 2018 година од заразениот клубенот компир одгледуван во регионот на Кострома. На клубенот влијаеше типот на сува гниење со празнина покриена со светло-кафеав мицелиум. Користејќи стерилна игла за дисекција, габичниот мицелиум беше пренесен во сад Петри со агар медиум (пивски кантарион 10%, агар 1.5%, пеницилин 1000 U / ml). Плочите беа инкубирани во темница на 24 ° С.
Лесен микроскоп Leica DM2500 со дигитален фотоапарат ICC50 HD и двогледен микроскоп Leica M80 со дигитален фотоапарат IC80HD (Leica Microsystems, Германија) беа користени за фотографирање, проценка на големината и морфологијата на спорите и органите на спорите.
За да се изолира ДНК, габичниот мицелиум се одгледуваше во течен грашок, потоа се замрзнуваше во течен азот, се хомогенизираше, се инкубираше во CTAB пуфер, се прочистува со хлороформ и се мие двапати со 2% алкохол.
Методот на екстракција на ДНК е детално опишан во статијата на Кутузова и сор. (2017)
За да се утврдат видовите со молекуларни методи и да се спореди со другите познати соеви на I. crassa, се спроведе PCR со прајмери што овозможуваат засилување на ДНК-регионите специфични за видовите: ITS1-5,8S-ITS2 (буквари ITS5 / ITS4, White et al., 1990), генски региони -тубулин (Bt2a / Bt2b, Глас, Доналдсон, 1995) и фактор на издолжување на преводот 1α (tef1α) (прајмери EF1-728F / EF1-986R, Карбон и Кон, 1999). Ампликоните со посакуваната должина беа извлечени од гелот со помош на комплетот Evrogen CleanUp. Засилените региони беа секвенцирани со помош на BigDye® Terminator v3.1 Кит Секвенционирање Комплет (Applied Biosystems, CA, USA) на Аплициран Biosystems 3730 xl автоматски секвенце (Applied Biosystems, CA, USA). Како резултат на нуклеотидните низи беа искористени за пребарување натпревар во базата на податоци на Националниот центар за информации за биотехнологија на САД (NCBI) GenBank. Филогенетската анализа беше извршена со помош на програмата МЕГА 6 (Тамура и сор., 2013).
Одредување на вирулентност беше извршено врз цели зелени плодови од крупноплоден домат (сорта Дубрава) и клубени од компир (сорта Гала). Покрај тоа, за да симулираме оштетување на оштетеното овошје и клубени, користевме парчиња од истото овошје и клубени. Парчиња клубени беа ставени во влажни комори, кои беа садови од Петри со влажна филтер-хартија на дното. На хартијата беше поставен слајд, на кој, пак, беа поставени парчиња клубени или овошје. Цели клубени и овошје исто така беа ставени во контејнери со влажна филтер-хартија на дното. Во центарот на парчето (или на недопрената површина на клубенот или овошјето), парче агар (5 × 5 mm) со габични хифи беше поставено по 5 дена одгледување на агар од кантарион.
Евалуација на отпорноста на габичните соеви на фунгициди беше спроведена во лабораториски услови на агар хранлив медиум. Ние ја проучувавме подложноста на фунгицидни лекови Maxim, KS (активна состојка флудиоксонил, 25 g / l), Quadris, KS (азоксистробин 250 g / l), Scor, EC (дифеноконазол 250 g / l) (Државен каталог ..., 2020). Евалуацијата беше извршена во садовите Петри на медиум-агар со додавање на испитуваните лекови во концентрација на активната супстанција од 0.1; еден; 1 ppm (mg / L) (за флудиоксонил и дифеноконазол), 10; десет; 1 ppm (за азоксистробин) и во медиум без фунгицид (контрола). Фунгицидот беше додаден во стопениот и ладен на 10 ° C медиум, по што медиумот се истури во садовите Петри. Агар блок со габичен мицелиум беше ставен во центарот на садот Петри и култивиран на температура од 100 ° C во мракот. По 60 дена инкубација, дијамерите на колониите беа измерени во две заемно нормални насоки; резултатите од мерењата за секоја колонија беа просечни. Експериментите беа извршени во три примероци. Врз основа на резултатите од анализите, пресметан е EC24, еднаков на концентрацијата на фунгицидот, што ја преполови стапката на радијален раст на колонијата во однос на контролата на фунгицидот.
Резултати и дискусија
На садовите од петри со агар од кантарион, габата формираше колонии со бел флокулентен мицелиум. Медиумот под мицелиумот стана црвено-кафеав. Кога медиумот се суши, габата формира спори од два вида на единечни и агрегирани конидиофори во мала спородохија. Макроконидиите се издолжени, цилиндрични, со еден до три септи, просечна должина од 27.2 μm со опсег на вредности од 23.2 до 32.2 μm, ширина - до 4.9 μm (слика 1). Просечната должина на микроконидијата е 14.3 μm со опсег на вредности од 10.3 до 18.1 μm, ширината е до 4.0 μm. Сите макро- и микроморфолошки карактери се вклопуваат во опсегот на варијации на видовите Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Секвенците на специфични за ДНК региони за видови (ITS, b-тубулин, TEF 1α) целосно се совпаднаа со низата на соевите I. crassa што ги проучувавме порано (Чудинова и сор., 2019, табела 1). Со цел да се проучи преваленцата на I. crassa во другите региони и да се анализира спектарот на погодените култури, беа анализирани слични ДНК секвенци во базата на податоци на GenBank (Табела 1). Преклопувањето беше од 86 до 100%. Секвенците на сите три ДНК региони на сојот „компир“ I. crassa беа идентични со низите на соевите изолирани од сијалицата на крин и нарцис во Холандија и од коренот на женшен во Канада. Не можевме да најдеме други соеви на I. crassa со три анализирани аналогни низи во отворените бази на податоци. Сепак, анализата на депонираните секвенци на ИТС и б-тубулин покажа присуство на I. crassa на лисјата од лале во Велика Британија. Габи со слична ИТЕ секвенца беа идентификувани при анализа на микобиотата на корените на аспенот во Канада и корените на бука во Италија и клубени од компири во Саудиска Арабија (Табела 1). Резултатите од оваа студија покажуваат дека I. crassa има глобална дистрибуција и е способен да зарази разни растителни видови.
При утврдување на патогеноста на парчиња домат и компир на 5-ти ден, дијаметарот на лезијата достигна 1.5 см.Истражениот сој не го зарази целото овошје од домати и непроменетиот клубенот од компири. Сепак, сепалите беа засегнати на доматот. За да се исклучи можноста од контаминација од мицелиумот развиен на парчето клубени од компир, изолиран е габичен изолат во чиста култура. Тоа беше целосно идентично со родителскиот вид. Очигледно, I. crassa е паразит на рани.
Пред-садење третман на семе клубени со фунгициди го намалува развојот на болести на растенијата во текот на сезоната на растење. За избор на ефективни фунгициди, важно е да се процени кои од нив се ефикасни против I. сrassa. Работата ги проучуваше широко распространетите активни супстанции на фунгициди - флудиоксонил, азоксистробин, дифеноконазол. Флудиоксонил е вклучен во неколку мешавини што се користат за облекување семе и клубени од семе пред садење. Флудиоксонил (Максим) исто така се користи за лекување на клубени од семе пред складирање. Дифеноконазолот и азоксистробинот исто така се вклучени во голем број препарати што се користат за преработка на семенски материјал, како и во препарати наменети за преработка на вегетативни растенија (Државен каталог ..., 2020).
Стапката на раст на I. crassa беше проучена на медиум (слика 2) со различни концентрации на активни состојки: флудиоксонил (EC50 = 0.4 ppm), азоксистробин (EC50 = 4 ppm) и дифеноконазол (EC50 = 7.4 ppm) (Табела 2). Овие препарати може да се сметаат за многу ефикасни против I. crassa, бидејќи нивниот EC50 е значително помал од препорачаната концентрација на препаратот во работната течност што се користи за лекување на клубени. Според Државниот каталог ... (2020), концентрацијата на флудиоксонил во течноста за третирање на компир клубени е од 500 до 1000 ppm, азоксистробин (во течноста за третирање на дното на браздата) - 3750-9375 ppm, дифеноконазол (во течноста за третирање на вегетативни растенија) - 187.5–625 XNUMX стр / мин.
Табела 1. Сличност на редоследот на специфичните видови на низи од сојот 18KSuPT2 и соевите на Ilyonectria crassa достапни во базата на податоци на Генбанк
Вирус | Фабрика домаќин, место за екскреција | Редоследни броеви депонирани во GenBank, процент на сличности | Линк | ||
НЕГОВИТЕ | β-тубулин | ТЕФ 1α | |||
17KSPT1 и 18KSuPT2 | Компир клубенот, регионот Кострома | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Чудинова и сор., 2019, ова дело |
CBS 158/31 | Корени на нарцис, Холандија | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Кабрал и сор., 2012 година |
CBS 139/30 | Сијалица од Лили, Холандија | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Корен од женшен, Канада | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Лист од лале, Велика Британија | KJ475469 100 | KJ513266 100 | НД | Дентон, Дентон, 2014 година |
MT294410 | Корени од Аспен, Канада | MT294410 100 | НД | НД | Рамсфилд и сор., 2020 година |
ER1937 | Бука, Италија | KR019363 99.65 | НД | НД | Тицани, Хаеги, Мота. Директно поднесување |
КАУФ19 | Компир клубенот, Саудиска Арабија | HE649390 98.3 | НД | НД | Гашгари, Гербави, 2013 година |
НД = не депониран
Табела 2. Отпорност на Ilyonectria crassa на фунгициди
(активна супстанција) | EC50, ppm | ||||
3 ден | 5 ден | 7 ден | |||
Контрола | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Квадрис, КС (фсоксистробин) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Максим, КС (флудиоксонил) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Скор, ЕЦ (дифеноконазол) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Во нашата работа, соединенијата I. crassa беа изолирани од клубени од компири во регионите Кострома и Москва (Чудинова и сор., 2019). Голем дел од габичните соеви со ИТС секвенци идентични со I. crassa беше откриен при анализа на микобиотата на клубени од компири во Саудиска Арабија (Гашгари и Гербави, 2013). Очигледно, I. crassa не е ретка кај компирите како што може да изгледа. Нашите експерименти покажаа дека габата може да зарази оштетени плодови од домати. Од литературата е познато дека I. crassa е способен да се развива сапротрофично во почвата (Мол и сор., 2016), како и да зарази разни растенија, дури и таксономски далечни, како што се нарциси, лилјани, женшен, јасика и бука (Табела 1). еден) Очигледно, многу диви и градинарски растенија можат да бидат резерви на I. crassa. Горенаведеното покажува дека при развивање на заштитни мерки, потребно е да се земе предвид можноста да се влијае на клубени од компири со оваа габа. Распространетите препарати за третман на компир клубени кои содржат флудиоксонил, азоксистробин и дифеноконазол покажаа висока ефикасност на фунгицид против I. crassa.
Оваа работа беше поддржана од Руската фондација за основно истражување (грант бр. 20-016-00139).
Написот е објавен во списанието „Билтен за заштита на растенијата“, 2020, 103 (3)