С.Н. Елански, Л.Ју. Кокаева, Н.В. Статјук, Ју.Т. Дјаков
Вовед
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, предизвикувачкиот агенс на доцната болест, економски најважната болест на компирот и доматот, го привлекува вниманието на истражувачите од различни земји повеќе од еден и пол век. Ненадејно појавувајќи се во Европа во средината на 19 век, предизвика епидемија на компир што остана во сеќавањето на многу генерации.
До денес, често се нарекува „ирска печурка за глад“. Речиси сто години по првите епидемии, откриени се диви мексикански видови компири отпорни на доцна лошо влијание, беа развиени методи за нивно вкрстување со култивирани компири (Muller, 1935) и беа добиени првите доцни сорти отпорни на лошо влијание (Пушкарев, 1937). . Меѓутоа, набргу по почетокот на нивното комерцијално одгледување, се акумулирале раси на патогенот на доцната болест кои биле вирулентни на отпорните сорти. и новите отпорни гени воведени во сорти од диви мексикански компири почнаа брзо да ја губат својата ефикасност.
Неуспесите со користење на моноген (вертикален) отпор ги принудија одгледувачите да бараат посложени начини за искористување на неспецифичен полигенски (хоризонтален) отпор. Во последниве години, многу агресивни раси почнаа да се акумулираат кај одредени популации на паразитот, предизвикувајќи ерозија дури и на неспецифичен отпор. Појавата на соеви отпорни на фунгициди предизвика проблеми во употребата на хемиски производи за заштита на компирот.
Поради значајните разлики помеѓу оомицетите и габите во хемискиот состав, ултраструктурата и метаболизмот, фунгицидите, особено системските, кои се користат за заштита на растенијата од многу габични заболувања, се неефикасни против оомицетите.
Затоа, при хемиска заштита од доцна лошо влијание, се користеа повеќекратни (до 12 пати во сезона или повеќе) прскања со препарати за контакт со широк спектар. Револуционерен чекор беше употребата на фениламиди, кои се токсични за оомицетите и системски дистрибуирани во растенијата. Сепак, нивната широка употреба брзо доведе до акумулација на отпорни соеви кај популациите на габи (Davidse et al., 1981), што значително ја комплицираше заштитата на растенијата. P. infestans е практично единствениот паразит на умерената зона, чии штети не можат да се неутрализираат во услови на органско земјоделство без употреба на хемиски средства за заштита (Van Bruggen, 1995).
Горенаведеното го објаснува огромното внимание што истражувачите од различни земји го посветуваат на проучувањето на популациите на P. infestans, динамиката на нивниот број и генетски состав, како и генетските механизми на варијабилност.
Животен циклус на R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans развива меѓуклеточен мицелиум со хаусторија во листовите на компирот. Со хранење на лисните ткива предизвикува формирање на темни дамки, кои поцрнуваат и гнијат на влажно време. Со сериозно оштетување, целиот лист умира. По одреден период на хранење, на мицелиумот се формираат израстоци - спорангиофори - кои растат нанадвор низ стоматите. На влажно време тие формираат бела обвивка околу дамките на долната страна на листовите. На краевите на спорангиофорите се формираат зооспорангија во облик на лимон, кои се откинуваат и се носат со прскање на дожд (сл. 1). Навлегувајќи во капки вода на површината на листот на компирот, спорангиите 'ртат во 6-8 зооспори, кои по одреден период на движење стануваат заоблени, покриени со мембрана и 'ртат во микробна цевка. Никулецот продира во ткивото на листот преку стомите. Под одредени услови, спорангиумот може да расте со микробна цевка директно во ткивото на листот. Под поволни услови, времето од инфекција до формирање на нова спорулација е само 3-4 дена.
Штом се на земја и се филтрираат низ почвата, спорангиите се способни да заразат клубени. Силно погодените клубени гнијат за време на складирањето; во слабо погодените области, инфекцијата може да трае до следната сезона. Дополнително, предизвикувачкиот агенс на доцната болест може да преживее во зима во форма на ооспори (сексуални спори со дебели ѕидови) во почвата на растителните остатоци и на семките од домати. Ооспорите се формираат на живите растителни органи кога соеви од различни типови на парење се среќаваат со вишок на влага. Во пролетта, на засадени инфицирани клубени и на остатоци од растенија со ооспори влегуваат во почвата и предизвикуваат инфекција на долните лисја на растенијата. Во некои случаи, мицелиумот може да расте од заразена кртула долж зелениот дел на растението и обично се појавува во горниот дел на стеблото.
Сериозна разлика помеѓу оомицетите и повеќето габи е доминацијата на диплофазата во нивниот животен циклус со гаметична мејоза и ртење на зиготи (ооспори) без редукција на нуклеарна поделба. Оваа карактеристика, плус диполарниот хетеротализам, кој ја заменува бисексуалноста, се чини дека овозможува да се применат пристапите на оомицети развиени за проучување на популации на повисоки еукариоти (анализа на панмиксија и поделба на популации, генски текови на интра- и интерпопулација итн.). Сепак, три фактори ги спречуваат овие пристапи да бидат целосно преносливи за проучување на популациите на P. infestans.
1. Заедно со хибридните ооспори, во популациите се формираат самоплодни и партеногенетски ооспори (Fife, Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Смирнов, 2003 година, зачестеноста на нивното формирање) и може да биде доволно за да влијае на резултатите од тестот.
2. Сексуалниот процес кај P. infestans дава незначителен придонес во динамиката на популацијата, бидејќи габата се репродуцира главно со вегетативни спори, формирајќи резултати од PCR анализа со употреба на специфични прајмери повеќе од 90% се совпаѓаат со резултатите од анализата на типот на парење во традиционалниот начин на хранлив медиум . сезоната на растење неколку генерации на асексуална спорулација (полицикличен развој на болеста). Ооспорите играат важна улога во зачувувањето на организмот во периодот кога нема зелени растенија (зима) и во примарната инфекција на садниците. Потоа, во текот на летото, се случува клонална репродукција и зголемување или, обратно, намалување на бројот на поединечни клонови кои произлегуваат како резултат на сексуалната рекомбинација, што се одредува главно со изборот на попогодни. Затоа, односот на поединечни клонови во популацијата на почетокот и крајот на епифитотијата може да биде сосема различен.
3. Опишаниот циклус е типичен за домородните популации на P. infestans во нивната татковина - Централна Америка. Во други области на светот, сексуалниот процес беше непознат повеќе од 100 години, фазата на презимување беше вегетативниот мицелиум во заразените клубени од компири. Животниот циклус беше целосно агамазен, а ширењето имаше фокална природа: инфекцијата од единечни заразени засадени клубени се прошири на лисјата, формирајќи примарни фокуси на болеста, кои може да се спојат со масовниот развој на болеста.
Така, во некои региони може да има алтернација на сексуални и асексуални циклуси, додека во други може да има само асексуален циклус.
Потекло на P. INFESTANS
P. infestans се појавува во Европа кон крајот на првата половина на 1991 век. Бидејќи компирот потекнува од североисточниот дел на Јужна Америка, се претпоставуваше дека паразитот од таму е донесен во Европа за време на чилеанскиот бум на шалитрата. Сепак, студиите спроведени на станицата за компири во Центарот Рокфелер во долината Толука (Мексико) принудија да се преиспита оваа гледна точка (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. Во долината Толука, локалните туберозни видови компири (Solanum demissum, S. bulbocastanum, итн.) имаат различни групи на гени за вертикална отпорност во комбинација со високо ниво на неспецифична отпорност, што укажува на долготрајна коеволуција со паразитот. Видовите од Јужна Америка, вклучително и култивираните компири, немаат гени за отпорност.
2. Во долината Толука се среќаваат изолати со типови на парење А1 и А2, како резултат на што е распространета вкрстена популација на P. infestans; додека во татковината на култивираниот компир, во Јужна Америка, паразитот се шири клонално.
3. Долината Толука доживува тешки годишни епидемии на доцна лошо влијание. Затоа, меѓу северноамериканските истражувачи (Универзитетот Корнел), постои воспоставено мислење за Мезоамерика (Централна Америка) како татковина на доцната болест на компирот (Goodwin et al., 1994).
Јужноамериканските истражувачи не го делат ова мислење. Тие веруваат дека култивираниот компир и нивниот паразит P. infestans имаат заедничка татковина - јужноамериканските Анди. Тие го поддржаа своето гледиште со молекуларни студии за анализа на ДНК полиморфизми на митохондријалниот геном (mtDNA) и нуклеарни гени RAS и β-тубулин (Gomez-Alpizar et al., 2007). Тие покажаа дека соевите собрани од различни локации ширум светот потекнуваат од три различни лоза на предците, од кои сите три биле пронајдени во јужноамериканските Анди. Андите хаплотипови се потомци на две лоза: изолатите од најстарата лоза на mtDNA се наоѓаат на дивите ноќни шипки од делот Anarrhicomenum во Еквадор, изолатите од втората лоза се вообичаени кај компирот, доматот и дивите ноќници. Во Толука, дури и ретките хаплотипови се изведени од само една лоза, при што генетската варијабилност на соевите на Толука (ниска алелна фреквенција на некои променливи места) сугерира силен ефект на основач поради неодамнешниот дрифт.
Дополнително, на Андите е пронајден нов вид на P. andina, морфолошки и генетски сличен на P. infestans, што, според авторите, ги означува Андите како жариште за специјација во родот Phytophthora. Конечно, во Европа и САД, популациите на P. infestans ги вклучуваат двете лоза на Андите, додека во Толука само една.
Оваа публикација поттикна одговор од група истражувачи од различни земји кои извршија обемна експериментална работа за да ја ревидираат претходната студија (Goss et al., 2014). Во оваа работа, прво, повеќе информативни микросателитски ДНК секвенци беа користени за проучување на ДНК полиморфизмите; второ, за анализа на кластерирање, миграциски правци, време на дивергенција на популации итн. користени се понапредни модели (F-статистички податоци, бајзиски апроксимации, итн.) и, трето, беше користена споредба не само со андскиот вид P. andina, во кој беше утврдена хибридната природа (P. infestans x Phytophthora sp.) , но и со мексиканските ендеми P. mirabilis, P. Ipomoeae и Phytophthoraphaseoli, кои се генетски блиски со P. infestans и припаѓаат на истата клада (Kroon et al., 2012). Како резултат на овие анализи, јасно се покажа дека коренскиот дел од филогенетското дрво на сите видови од родот Phytophthora земени во студијата, освен хибридниот P. andina, припаѓа на мексиканските соеви, а миграцискиот тек има насока Мексико - Андите, а не обратно, а нејзиниот почеток се совпаѓа со европската колонизација на Новиот свет (пред 300-600 години). Така, појавата на видот P. infestans, специјализиран за оштетување на компирот, се случи во секундарниот генетски центар на формирање на туберозни ноќни шишки, т.е. во Централна Америка.
Геномот на P. infestans
Во 2009 година, меѓународен тим на научници го секвенционираше целосниот геном на P infestans (Haas et al, 2009), чија големина беше 240 Mb. Ова е неколку пати повеќе од онаа на тесно сродниот вид P. sojae (95 Mb), кој предизвикува гниење на коренот на сојата, и P. Ramorum (65 Mb), кој влијае на таквите вредни видови дрвја како дабот, буката и некои други. Добиените податоци покажаа дека геномот содржи голем број копии на секвенци што се повторуваат - 74%. Геномот содржи 17797 гени за кодирање на протеини, од кои најголемиот дел се гени вклучени во клеточните процеси, вклучувајќи репликација на ДНК, транскрипција и транслација на протеините.
Споредбата на геномите од родот Phytophthora откри необична организација на геномот, која се состои од блокови на конзервирани генски секвенци, во кои генската густина е релативно висока и содржината на повторените секвенци е релативно ниска, и одделни региони со неконзервирани генски секвенци , со мала генска густина и висока содржина на повторени региони. Конзервираните блокови сочинуваат 70% (12440) од сите гени за кодирање на протеини во P. infestans. Во рамките на конзервираните блокови, гените обично се блиску лоцирани со просечно меѓугенско растојание од 604 bp. Во регионите помеѓу зачуваните блокови, меѓугенското растојание е поголемо (3700 bp) поради зголемувањето на густината на елементите што се повторуваат. Ефекторните секреторни гени кои брзо се развиваат се лоцирани во региони со мало генско изобилство.
Анализата на геномските секвенци на P. infestans покажа дека приближно една третина од геномот припаѓа на транспонирани елементи. Геномот на P. infestans содржи значително повеќе различни фамилии на транспозони од другите познати геноми. Најголем дел од транспозоните во P. infestans припаѓаат на семејството Цигани.
Геномот на P. infestans откри голем број специфични генски семејства вклучени во патогенезата. Значаен дел од нив кодираат ефекторни протеини кои ја менуваат физиологијата на растението домаќин и придонесуваат за нејзина инфекција. Тие спаѓаат во две широки категории: апопластични ефектори, кои дејствуваат во меѓуклеточните простори (апопласти) и цитоплазматски ефектори, кои влегуваат во клетките преку хаусторија. Апопластичните ефектори вклучуваат секретирани хидролитички ензими како што се протеази, липази и гликозилази кои ги уништуваат растителните клетки; инхибитори на одбранбените ензими на растенијата домаќини и некротизирачки токсини како што се протеините слични на Nep1 (NPLs) и малите протеини богати со цистеин слични на Pcf (SCRs).
Ефекторните гени на P. infestans се многубројни и обично поголеми по големина во споредба со непатогените гени. Најпознати цитоплазматски ефектори се RXLR и Crinkler (CNR). Типични цитоплазматски ефектори за оомицети се RXLR протеините. Сите RXLR ефекторни гени откриени досега ја содржат амино-терминалната група Arg-XLeu-Arg, каде што X претставува амино киселина. Студијата сугерираше присуство на 563 RXLR гени во геномот на P. infestans, што е за 60% повеќе од оној на P. sojae и P. ramorum. Приближно половина од RXLR гените во геномот на P. infestans се специфични за видовите. RXLR ефекторите имаат широк спектар на секвенци. Меѓу нив идентификувани се едно многудетно и 150 мали семејства. За разлика од јадрото на протеомот, ефекторните гени RXLR обично се лоцирани во региони на геномот сиромашни со гени, богати со повторување. Транспонираните елементи кои ги прават овие региони динамични промовираат рекомбинација во овие гени.
Цитоплазматските CRN ефектори првично беа идентификувани во транскриптите на P. infestans кои кодираат пептиди кои индуцираат некроза на растително ткиво. Од нивното откритие, малку е познато за семејството на овие ефектори. Анализата на геномот на P. infestans откри огромна фамилија од 196 CRN гени, значително поголеми од оние на P. sojae (100 CRN) и P. ramorum (19 CRN). Како и RXLR, CRN се модуларни протеини и се состојат од високо зачуван N-терминален LFLAK домен (50 амино киселини) и близок DWL домен кој содржи различни гени. Поголемиот дел од CRN (60%) поседуваат сигнален пептид.
Проучен е потенцијалот на различни CRN да ги нарушат клеточните процеси на растението домаќин. Во анализата на растителна некроза, отстранувањето на CRN2 протеините овозможи да се идентификува Ц-терминалниот регион кој се состои од 234 амино киселини (позиции 173-407, домен DXG) што предизвикува клеточна смрт. Анализата на CRN гените на P. infestans откри четири различни C-терминални региони кои исто така предизвикуваат клеточна смрт во растението. Тие ги вклучуваат првите идентификувани DC домени (P. infestans има 18 гени и 49 псевдогени), како и D2 (14 и 43) и DBF (2 и 1) домени, кои се слични на протеинските кинази. Протеините на CRN доменот изразени во растенијата опстојуваат (во отсуство на сигнални пептиди) во растителната клетка и ја стимулираат клеточната смрт преку интрацелуларен механизам. Други 255 секвенци што содржат CRN домен веројатно не функционираат како гени.
Зголемувањето на бројот и големината на фамилиите на ефекторни гени RXLR и CRN веројатно се должи на не-алелната хомологна рекомбинација и дуплирање на гените. И покрај фактот дека геномот содржи голем број активни транспонирани елементи, сè уште нема директни докази за трансфер на ефекторни гени.
Методи кои се користат при проучување на структурата на населението
Студијата за генетската структура на популациите моментално се заснова на анализа на чисти култури на нејзините составни соеви. Анализа на популации без изолирање на чисти култури се врши и за одредени цели, како што е, на пример, проучување на агресивноста на популацијата или присуството на соеви отпорни на фунгициди во неа (Филипов и сор., 2004, Деревјагина и др., 1999). Овој тип на истражување вклучува употреба на специјални методи, чиј опис е надвор од опсегот на овој преглед. За компаративна анализа на соеви, се користат голем број методи, базирани и на анализа на структурата на ДНК и на проучување на фенотипските манифестации. При изведување на компаративна анализа на популациите, треба да се справиме со голем број изолати, што наметнува одредени барања за методите што се користат. Идеално, тие треба да ги исполнуваат следните барања (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- да биде евтин, лесен за имплементација, да не бара значително време и да се заснова на јавно достапни технологии (на пример, PCR);
— мора да генерира доволно голем број на независни кодоминантни маркерски карактеристики;
— имаат висока репродуктивност;
— користете минимална количина на ткиво што се испитува;
— да биде специфична за подлогата (контаминацијата присутна во културата не треба да влијае на резултатите);
- не бараат употреба на опасни процедури и високо токсични хемикалии.
За жал, не постојат методи кои ги исполнуваат сите горенаведени параметри. За компаративно проучување на соеви, сега се користат методи врз основа на анализа на фенотипските карактеристики: вирулентност на сортите на компири и домати (раси од компири и домати), тип на парење, спектри на пептидаза и изоензими на глукоза-6-фосфат изомераза и анализа на Структура на ДНК: анализа на рестриктивен фрагмент на полиморфизам на должина (RFLP), која обично се надополнува со сонда за хибридизација RG 57, анализа на повторување на микросателитот (SSR и InterSSR), засилување со случајни прајмери (RAPD), засилување на рестриктивен фрагмент (AFLP), засилување со прајмери хомологни секвенци на транспонирани елементи (на пример, Inter SINE PCR), определување на хаплотипови на митохондријална ДНК.
Кратки описи на методите за компаративно проучување на соеви кои се користат при работа со P. infestans
Фенотипски маркерски карактеристики
Трки „Компир“.
Трките „Компир“ се често истражуван и користен маркер. Расите „прости компири“ имаат еден ген за вирулентност на компирот, а „комплексните“ раси имаат најмалку два. Блек и сор. , 1953 и 1 кои ги инфицираат растенијата со гени R2, R3, R4 и R1, соодветно, т.е. Интеракцијата помеѓу паразитот и домаќинот се случува според принципот „ген до ген“. Понатаму, Блек, со учество на Галегли и Малколмсон, ги открил гените за отпор R2, R3, R4, R5, R6, R7 и R8, како и нивните соодветни раси (Black, 9; Black & Gallegly, 10; Malcolmson & Black , 11 Малколмсон, 1954).
Постои широка низа на податоци за расниот состав на патогенот од различни региони. Без детално да ги анализираме овие податоци, ќе го посочиме само општиот тренд: каде што се користеа сорти со нови гени за отпорност или нивни комбинации, најпрво имаше одредено слабеење на доцната болест, но потоа се појавија и беа избрани раси со соодветните вирулентни гени. а епидемиите на доцната болест повторно продолжија. Специфична вирулентност против првите 4 гени на отпорност (R1-R4) ретко беше забележана во збирките собрани пред воведувањето на сорти со овие гени во одгледувањето, но бројот на вирулентни соеви нагло се зголеми кога патогенот паразитираше сорти што ги носат овие гени. Гените 5-11, напротив, беа пронајдени доста често во збирките (Шо, 1991).
Студијата за односот на различни раси во текот на сезоната на растење, спроведена кон крајот на 1980-тите, покажа дека на почетокот на развојот на болеста, во популацијата преовладуваат клонови со мала агресивност и 1-2 вирулентни гени.
Понатаму, како што се развива доцна лошо влијание, концентрацијата на почетните клонови се намалува и бројот на „комплексни“ раси со висока агресивност се зголемува. Инциденцата на второто достигнува 100% до крајот на сезоната. При складирање на клубени, постои намалување на агресивноста и губење на индивидуалните вирулентни гени. Динамиката на замената на клоновите може да се појави различно кај различни сорти (Rybakova & Dyakov, 1990). Сепак, нашите студии спроведени во 2000-2010 година покажаа дека сложените раси биле пронајдени од самиот почеток на епифитотијата меѓу соеви изолирани и од компири и од домати. Ова најверојатно се должи на промените во популацијата на P. infestans во Русија.
До 1988-1995 година, појавата на „супер раси“ кои ги имаат сите или речиси сите вирулентни гени во различни региони достигна 70-100%. Оваа ситуација беше забележана, на пример, во Белорусија, во Ленинград, московските региони, во Северна Осетија и во Германија (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Polityko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Трки „домати“.
Кај сортите домати, пронајдени се само два гена за отпорност на доцна лошо влијание: Ph2 (Gallegly & Marvell, 1) и Ph1955 (Al-Kherb, 2). Како и во случајот со расите со компири, интеракцијата помеѓу доматите и P. infestans се случува според принципот „ген за ген“. Расата Т1988 ги инфицира сортите кои немаат гени за отпор (најмногу индустриски користени сорти), расата Т0 ги инфицира сортите со генот Ph1 (Отава), расата Т1 ги инфицира сортите со генот Ph2.
Во Русија, речиси исклучиво Т0 беше пронајден на компири; на доматите, Т0 преовладуваше на почетокот на сезоната, но подоцна беше заменет со трката Т1 (Дјаков и сор., 1975, 1994). По 2000 година, Т1 на компирот почна да се јавува кај многу популации на самиот почеток на епифитотијата. Во САД, соеви кои не се патогени за доматите, како и расите T0, T1 и T2, беа пронајдени на компирот, додека T1 и T2 доминираа на доматите (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Тип на парење
За да се спроведе студијата, потребни се тестери (референтни) соеви со познати типови на парење - А1 и А2. Испитниот изолат се сее со нив во парови во петриеви садови со медиум за овес агар. По инкубација 10 дена, садовите се испитуваат за присуство или отсуство на ооспори во медиумот во контактната зона на соевите. Постојат 4 можни опции: сојот припаѓа на типот на парење А1 ако формира ооспори со тестерот А2, на А2 ако формира ооспори со тестерот А1, на А1А2 ако формира ооспори со двата тестери или е стерилен (00) ако е не формира ооспори не со ниеден тестер (последните две групи се ретки).
За побрзо одредување на типовите на парење, беа направени обиди да се идентификуваат геномските региони поврзани со типот на парење, со цел нивна понатамошна употреба за одредување на типот на парење со PCR. Американските истражувачи беа меѓу првите кои спроведоа успешен експеримент за да идентификуваат такво место (Judelson et al., 1995). Користејќи го методот RAPD, тие беа во можност да го идентификуваат регионот W16 поврзан со типот на парење кај потомците на два вкрстени изолати и да дизајнираат пар од 24-нуклеотидни прајмери за да го засилат (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3') и W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTTC-3' По рестрикција на PCR-производот со користење на рестриктивниот ензим HaeIII, беше можно да се одвојат изолатите со типови на парење A1 и A2).
Друг обид да се добијат PCR маркери за да се одредат типовите на парење беше направен од корејски истражувачи (Ким и Ли, 2002). Тие идентификуваа специфични производи користејќи го методот AFLP. Како резултат на тоа, беше развиен пар прајмери PHYB-1 (напред) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3') и PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), овозможувајќи селективно засилување на регионот на геномот поврзан со А2 тип на парење. Последователно, тие ја продолжија оваа работа и дизајнираа прајмери 5' AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, напред) и 5'-GCGTTTCTTTCGTATTACCAC-3' (INF-2), овозможувајќи селективно засилување на регионот Mat-A1, карактеристичен за соеви со тип на парење А1. Употребата на PCR дијагностика на типовите на парење покажа добри резултати во проучувањето на популациите на P. infestans во Чешка (Mazakova et al., 2006), Тунис (Jmour, Hamada, 2006) и други региони. Во нашата лабораторија (Mytsa, Elansky, необјавено), беа анализирани 34 соеви на P. infestans изолирани од засегнатите органи на компир и домати во различни региони на Русија (региони Кострома, Рјазан, Астрахан, Москва). Резултатите од PCR анализата со употреба на специфични прајмери се совпаднаа за повеќе од 90% со резултатите од анализата на типот на парење со користење на традиционалниот метод на хранлива средина.
Табела 1. Варијабилност на отпорот во рамките на клонот Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Локација за собирање примероци | Број на анализирани изолати | Број на чувствителни (S), слабо отпорни (SR) и отпорни (R) соеви, парчиња (%) | ||
S | SR | R | ||
Владивосток | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
Г. Чита | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Г. Иркутск | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
Краснојарск | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
град Екатеринбург | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
О. Сахалин | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Регионот Омск | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Отпорност на металаксил како популациски маркер
Во раните 1980-ти, сериозни епидемии на доцна лошо влијание предизвикани од соеви на P. infestans отпорни на металаксил беа пријавени во различни региони. Фармите за компири во многу земји претрпеа значителни загуби (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse et al., 1983; Derevyagina, 1991). Оттогаш, многу земји ширум светот континуирано ја следат појавата на соеви отпорни на фениламид кај популациите на P. infestans. Покрај практичната проценка на изгледите за употреба на лекови кои содржат фениламид, конструирање систем на заштитни мерки и предвидување на епифитотиите, отпорноста на овие лекови стана една од маркерските карактеристики што широко се користат за компаративна анализа на популациите на овој патоген. Сепак, употребата на отпорност на металаксил во компаративните испитувања на населението треба да се спроведе земајќи го предвид фактот дека: 1 - генетската основа на отпорност сè уште не е прецизно одредена, 2 - отпорноста кон металаксил е селективно зависна карактеристика, способна за се менува во зависност од употребата на фениламиди, 3 - различен степен на чувствителност на соеви на металаксил во една клонална линија (Табела 1).
Изоензимски спектри
Изоензимските маркери обично се независни од надворешните услови, покажуваат менделово наследство и се кодоминантни, што овозможува да се направи разлика помеѓу хомо- и хетерозиготи. Употребата на протеини како генски маркери овозможува да се идентификуваат и големите реорганизации на генетскиот материјал, вклучувајќи хромозомски и геномски мутации, и замена на една аминокиселина.
Електрофоретските студии на протеините покажаа дека повеќето ензими постојат во организмите во форма на неколку фракции кои се разликуваат во електрофоретската подвижност. Овие фракции се резултат на кодирање на повеќе форми на ензими од различни локуси (изозими или изозими) или различни алели од истиот локус (алозими или алозими). Тоа е, изозимите се различни форми на истиот ензим. Различни форми имаат иста каталитичка активност, но малку се разликуваат во замените на единечни аминокиселини во составот на пептидите и одговорните. Ваквите разлики се откриваат со електрофореза.
При проучување на соеви на P. infestans, се користат спектрите на изоензими на два протеини: пептидаза и глукоза-6-фосфат изомераза (овој ензим е мономорфен кај руската популација, па методите за негово проучување не се дадени во оваа работа). За да се разделат во изозими во електрично поле, протеинските препарати изолирани од организмите што се проучуваат се нанесуваат на гел-плоча сместена во електрично поле. Стапката на дифузија на поединечни протеини во гел зависи од полнежот и молекуларната тежина, затоа, во електричното поле, мешавината на протеини се дели на посебни фракции, кои може да се визуелизираат со помош на специјални бои.
Проучувањето на изоензимите на пептидаза се врши на целулоза ацетат, скроб или полиакриламид гелови. Најпогодниот метод се заснова на употреба на гелови со целулоза ацетат произведени од Helena Laboratories Inc. Не бара големи количини на материјали за тестирање, овозможува да се добијат контрастни ленти на гелот по електрофореза за двата ензимски локуси и не бара големи количини на време и пари (сл. 2).
Мало парче мицелиум се пренесува во микроцевка од 1,5 ml и во него се додаваат 1-2 капки дестилирана вода. По ова, примерокот се хомогенизира (на пример, со електрична дупчалка со пластичен додаток погоден за микроцевка) и се седиментира 25 секунди во центрифуга со 13000 вртежи во минута. Од секоја микроцевка, 8 µl. супернатантот се пренесува на апликаторската плоча.
Целулоза ацетат гелот се отстранува од тампон-контејнерот, се брише помеѓу два листа филтер-хартија и се става со работниот слој свртен нагоре на пластичната основа на апликаторот. Растворот од плочата со апликаторот се пренесува во гелот 2-4 пати. Гелот се пренесува во комора за електрофореза,
Табела 2. Состав на растворот што се користи за боење на гел од целулоза ацетат при анализа на изоензимите на пептидаза: капка боја (бромофенол сина) се става на работ на гелот.
TRIS HCl, 0,05M, Ph 8,0 2 ml
Пероксидаза, 1000 U/ml 5 капки
о-дијанизидин, 4 mg/ml 8 капки
MgCl2, 20 mg/ml 2 капки
Gly-Leu, 15 mg/ml 10 капки
L-амино-киселина оксидаза, 20 u/ml 2 капки
Електрофорезата се изведува 20 минути. на 200 V. По електрофореза гелот се префрла на сликарска маса и се бојадисува со специјален раствор за бојадисување (Табела 2). 10 ml од 1,6% DIFCO агар се претопува во микробранова печка, се лади на 60°C, по што 2 ml агар се меша со смесата за боја и се прелива врз гелот. Пругите се појавуваат во рок од 15-20 минути. Реагенсот L-амино-киселина оксидаза се додава непосредно пред да се меша растворот со стопениот агар.
Во руската популација, локусот Пеп 1 е претставен со генотипови 100/100 и 92/100. Хомозиготот 92/92 е исклучително редок (околу 0,1%). Локусот Пеп 2 е претставен со три генотипови 100/100, 100/112 и 112/112, а сите 3 варијанти се доста чести (Elanky, Smirnov, 2003, Сл. 2).
Истражување на геномот
Полиморфизам со должина на рестриктивен фрагмент проследен со хибридизација (RFLP-RG 57)
Вкупната ДНК се третира со рестриктивен ензим Eco R1, фрагментите на ДНК се одвојуваат со помош на електрофореза на агарозен гел. Нуклеарната ДНК е многу голема и има многу секвенци кои се повторуваат, што ја отежнува директната анализа на бројни фрагменти добиени од рестриктивните ензими. Затоа, фрагментите на ДНК одвоени во гелот се пренесуваат во посебна мембрана и се користат за хибридизација со сондата RG 57, која содржи нуклеотиди означени со радиоактивни или флуоресцентни ознаки. Оваа сонда се хибридизира со многу повторувачки секвенци во геномот (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). По визуелизирање на резултатите од хибридизацијата на материјал чувствителен на светлина или радиоактивно, се добива повеќелокусен хибридизациски профил (отпечаток од прсти), претставен со 25-29 фрагменти (Forbes et al., 1998). Асексуалните (клонални) потомци ќе имаат идентични профили. Според локацијата на лентите на електроферограмот, се оценуваат сличностите и разликите на организмите што се споредуваат.
Хаплотипови на митохондријална ДНК
Во повеќето еукариотски клетки, mtDNA е претставена во форма на двоверижна кружна ДНК молекула, која, за разлика од нуклеарните хромозоми на еукариотските клетки, се реплицира полуконзервативно и не е поврзана со протеинските молекули.
Митохондријалниот геном на P. infestans е секвенциониран и голем број дела се посветени на анализата на должините на рестриктивните фрагменти (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino and Fry, 2002). Откако Грифит и Шо (1998) развија едноставен и брз метод за одредување на хаплотиповите на mtDNA, овој маркер стана еден од најпопуларните во студиите на P. infestans. заедничкиот геном) со прајмери F2-R2 и F4-R4 (Табела 3) и нивно последователно ограничување со користење на рестриктивни ензими MspI (прв фрагмент) и EcoR1 (втор фрагмент). Методот ни овозможува да идентификуваме 1 хаплотипови: Ia, IIa, Ib, IIb. Типот II се разликува од типот I по присуството на вметнување од 2 bp и различна локација на местата за ограничување во P4 и P1881 регионите (сл. 2).
Од 1996 година, меѓу соевите собрани во Русија, забележани се само хаплотипови Ia и IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Тие можат да се идентификуваат по одвојување на рестриктивните производи со прајмер F2-R2 во електрично поле (сл. 4, 5). mtDNA типовите се користат во компаративни анализи на соеви и популации. Во голем број студии, типовите на митохондријална ДНК беа користени за да се идентификуваат клоналните линии и да се потврдат изолатите на P. infestans (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Користејќи го методот PCR-RFLP, беше заклучено дека mtDNA е хетерогена во истиот сој на P. infestans (Elansky, Milyutina, 2007). Услови за засилување: 1x (500 сек. 94°C), 40x (30 сек. 90°C, 30 сек. 52°C, 90 сек. 72°C); 1x (5 мин. 72°C). Реакциона мешавина: (20 µl): 0,2 U Taq DNA полимераза, 1x 2,5 mM MgCl2-Taq пуфер, 0,2 mM секој dNTP, 30 pM прајмер и 5 ng тест ДНК, дејонизирана вода - до 20 µl.
Ограничувањето на производот PCR се врши 4-6 часа на температура од 37°C. Мешавина за ограничување (20 µl): 10x MspI (2 µl), 10x рестриктивен пуфер (2 µl), дејонизирана вода (6 µl), PCR производ (10 µl).
Табела 3. Прајмери кои се користат за засилување на полиморфните области на mtDNA
Локус | Primer | Должина и поставеност на прајмерот | Должина на PCR производ | Рестриктивен ензим |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | ЕКОРИ |
R4: 5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Случајно засилување на прајмер (RAPD)
При изведување на RAPD, се користи еден прајмер (понекогаш неколку прајмери истовремено) со произволна нуклеотидна низа, обично со должина од 10 нуклеотиди, со висока содржина (од 50%) на GC нуклеотиди и ниска температура на жарење (околу 35ºC). Таквите прајмери „седат“ на бројни комплементарни места во геномот. По засилувањето се добиваат голем број на ампликони. Нивниот број зависи од употребениот прајмер(и) и условите на реакција (концентрација на MgCl2 и температура на жарење).
Ампликоните се визуелизираат со работа на гел од полиакриламид или агароз. При спроведување на RAPD анализа, потребно е внимателно да се следи чистотата на анализираниот материјал, бидејќи контаминација од други живи објекти може да предизвика значително зголемување на бројот на артефакти, кои се доста бројни дури и кога се анализира чист материјал (Perez et al, 1998). Употребата на овој метод во проучувањето на геномот на P. infestans се рефлектира во многу трудови (Judelson и Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Изборот на условите за реакција и прајмери (51 10-нуклеотидни прајмери беа проучувани) е даден во статијата од Abu-El Samen et al., (2003).
Микросателитна повторена анализа (SSR).
Микросателитски повторувања (едноставни повторувања на секвенци, SSRs) се тандемно повторувани кратки секвенци од 1-3 (понекогаш и до 6) нуклеотиди присутни во нуклеарните геноми на сите еукариоти. Бројот на последователни повторувања може да варира од 10 до 100. Микросателитски локуси се јавуваат со прилично висока фреквенција и се повеќе или помалку рамномерно распоредени низ геномот (Lagercrantz et al., 1993). Полиморфизмот на секвенците на микросателитите е поврзан со разлики во бројот на повторувања на основниот мотив. Микросателитски маркери се кодоминантни, што им овозможува да се користат за анализа на структурата на населението, одредување на сродство, миграциски патишта на генотипови итн. Меѓу другите предности на овие маркери, треба да се забележи нивниот висок полиморфизам, добра репродуктивност, неутралност и можноста за автоматска анализа и евалуација. Првично, анализата беше спроведена со одвојување на реакционите производи на полиакриламид гел. Подоцна, вработените во компанијата Applied Biosystems предложија употреба на флуоресцентно означени прајмери со детекција на реакциони производи со помош на автоматски ласерски детектор (Diehl et al., 1990), а потоа и стандардни автоматски секвенционери на ДНК (Ziegle et al., 1992). Означувањето на прајмери со различни флуоресцентни бои овозможува да се анализираат неколку маркери на една лента одеднаш и, соодветно, значително да се зголеми продуктивноста на методот и да се подобри точноста на анализата.
Првите публикации посветени на употребата на SSR анализа за проучување на P. infestans се појавија во раните 2000-ти. (Кнапова, Гиси, 2002). Не сите маркери предложени од авторите покажаа доволен степен на полиморфизам, сепак, два од нив (4B и G11) беа вклучени во сетот од 12 маркери за SSR предложени од Lees et al (2006) и потоа прифатени во Eucablight истражувачка мрежа (www.eucablight .org) како стандард за P. infestans. Неколку години подоцна, беше објавена студија за создавање на мултиплекс систем за анализа на ДНК за P. infestans врз основа на осум SSR маркери (Li et al., 2010). Конечно, по евалуацијата на сите претходно предложени маркери и изборот на најинформативните, како и оптимизирањето на прајмерите, флуоресцентните ознаки и условите за засилување, истиот тим на автори претстави систем за мултиплексна анализа во еден чекор кој вклучува 12 маркери (Табела 4; Li et al. , 2013а). Прајмерите што се користат во овој систем беа избрани и означени со еден од четирите флуоресцентни маркери (FAM, VIC, NED, PET) така што опсегот на големината на алелите на прајмери со исти ознаки не се преклопува.
Авторите ја извршија анализата на термо циклер PTC200 (MJ Research, САД) користејќи QIAGEN мултиплекс PCR или QIAGEN Typeit Microsatellite PCR комплети. Волуменот на реакционата смеса беше 12.5 µl. Условите за засилување беа како што следува: за QIAGEN мултиплекс PCR: 95ºC (15 мин), 30x (95ºC (20 s), 58ºC (90 s), 72ºC (60 s), 72ºC (20 мин); за QIAGEN Type-it Microsatellite PCR : 95ºС (5 мин), 28х (95ºС (30 сек), 58ºС (90 сек), 72ºС (20 сек), 60ºС (30 мин).
Сепарацијата и визуелизацијата на производите на PCR беше извршена со помош на автоматизиран капиларен ДНК анализатор ABI3730 (Applied Biosystems).
Табела 4. Карактеристики на 12 стандардни SSR маркери кои се користат за генотипирање на P. infestans (Li et al., 2013a)
Име | Број на алели | Опсег на големина алели (bp) | Прајмери |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Пи02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | F: FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | F: FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTCAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | F: FAM-TCTTGTTCGAGTATGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Пи04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTACCGATGG R: GTTTCAGGCGGCTGTTTCGAC |
Пи70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Пи63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Пример за визуелизација на резултатите од анализата е прикажан на сл. 6. Резултатите беа анализирани со помош на програмата GeneMapper 3.7 со споредување на податоците добиени со податоците од познатите изолати. За да се олесни толкувањето на резултатите од тестот, секоја студија треба да вклучува 1-2 референтни изолати со познат генотип.
Предложениот метод на истражување беше тестиран на значителен број теренски примероци, по што авторите ги стандардизираа протоколите помеѓу лабораториите на две организации, Институтот Џејмс Хатон (Велика Британија) и Универзитетот и Истражување Вагенинген (Холандија), кои заедно со можноста за користење стандардните FTA картички за поедноставено собирање и испорака на примероци на ДНК од P. infestans ни овозможија да зборуваме за можноста за комерцијална употреба на овој развој. Дополнително, брзиот и точен метод на генотипизација на изолатите на P. infestans со помош на мултиплекс SSR анализа овозможи да се спроведат стандардизирани студии за популациите на овој патоген на глобално ниво и создавање на глобална база на податоци за доцна лошо влијание во рамките на Проектот Eucablight (www.eucablight.org), вклучувајќи ги и резултатите од анализата на микросателитите, овозможи да се следи појавата и ширењето на нови генотипови низ целиот свет.
Засилен полиморфизам на должина на рестриктивен фрагмент (AFLP). AFLP (засилен полиморфизам со должина на фрагмент) е технологија за добивање случајни молекуларни маркери со помош на специфични прајмери. Во AFLP, ДНК се третира со комбинација од два рестриктивни ензими. Специфичните адаптери се врзуваат на лепливите краеви на фрагментите за ограничување.
Овие фрагменти потоа се засилуваат со употреба на прајмери комплементарни на секвенцата на адаптерот и местото на ограничување, и дополнително носат една или повеќе случајно избрани бази на нивните 3' краеви. Множеството на добиени фрагменти зависи од рестриктивните ензими и случајно избраните нуклеотиди на 3' краевите на прајмерите (Vos et al., 1995). AFLP генотипизацијата се користи за брзо проучување на генетската варијабилност на различни организми.
Детален опис на методот е даден во Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul et al., 1999. Многу работа е направена од кинески истражувачи за да се спореди резолуцијата на методите AFLP и SSR. Беа проучувани фенотипските и генотипските карактеристики на 48 изолати на P. infestans собрани од пет региони на Северна Кина. Спектрите AFLP открија осум различни генотипови на ДНК, за разлика од генотиповите SSR, за кои не беше идентификувана различност (Guo et al., 2008).
Засилување со прајмери хомологни на секвенци на транспонирани елементи
Маркерите добиени од ретротранспозонските секвенци се многу корисни за генетско мапирање, проучување на генетската разновидност и еволутивните процеси (Шулман, 2006). Ако правите прајмери кои се комплементарни со стабилните секвенци на одредени мобилни елементи, можете да ги засилите геномските региони лоцирани меѓу нив. Во студиите за предизвикувачкиот агенс на доцна лошо влијание, успешно се користеше методот на засилување на делови од геном со користење на прајмер комплементарен на основната секвенца на ретропазонскиот SINE (Кратки прошарани нуклеарни елементи) (Lavrova, Elansky, 2003). Користејќи го овој метод, беа откриени разлики дури и кај асексуалните потомци на истиот изолат. Во овој поглед, беше заклучено дека методот inter-SINE PCR е високо специфичен и брзината на движење на SINE елементите во геномот Phytophthora е висока.
Дванаесет фамилии на кратки ретротранспонзони (SINE) се идентификувани во геномот на P. infestans; Проучена е дистрибуцијата на видовите на кратки ретротранспонзони, идентификувани се елементи (SINEs) кои се наоѓаат во геномот само на P. infestans (Лаврова, 12).
Карактеристики на примена на методи за компаративно проучување на соеви во популациони студии
При планирањето на студијата, неопходно е јасно да се разберат целите што ги следи и да се користат соодветни методи. Така, некои методи овозможуваат да се генерираат голем број независни карактеристики на маркери, но во исто време тие имаат ниска репродуктивност и се многу зависни од употребените реагенси, условите на реакцијата и контаминацијата на материјалот што се проучува. Затоа, во секоја студија на група соеви неопходно е да се користат неколку стандардни (референтни) изолати, но дури и тогаш резултатите од неколку експерименти се многу тешко да се комбинираат.
Оваа група на методи вклучува RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. По засилување се добиваат голем број ДНК фрагменти со различна големина. Препорачливо е да се користат такви техники кога е неопходно да се утврдат разлики помеѓу тесно поврзани соеви (родители-потомци, диви мутанти итн.) или во случаи кога е потребна детална анализа на мал примерок. Така, методот AFLP е широко користен во генетското мапирање на P. infestans (van der Lee et al., 1997) и во студиите за интрапопулација (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Не е препорачливо да се користат такви методи при креирање на бази на податоци за сој, бидејќи Речиси е невозможно да се обедини евидентирањето на резултатите при спроведување на анализи во различни лаборатории.
И покрај очигледната едноставност и брзина на извршување (изолација на ДНК без добро прочистување, засилување, визуелизација на резултатите), оваа група методи бара употреба на посебен метод за документирање на резултатите: дестилација во полиакриламид гел со означено (радиоактивно или луминисцентно) прајмери и последователно осветлување на материјал чувствителен на светлина или радиоактивно. Конвенционалното сликање со гел со етидиум бромид агароза генерално не е погодно за овие методи бидејќи може да се спојат голем број ДНК фрагменти со различна големина.
Другите методи, напротив, овозможуваат генерирање на мал број карактеристики со многу висока репродуктивност. Оваа група вклучува проучување на хаплотипови на митохондријална ДНК (во Русија се забележани само два хаплотипа Ia и IIa), тип на парење (повеќето изолати се поделени на 2 типа: A1 и A2, само-плодните SF се ретки) и спектри на изоензими на пептидаза ( два локуси Pep1 и Pep2, кои се состојат од по два изозими) и гликоза-6-фосфат изомераза (во Русија нема варијабилност во оваа особина, иако значителен полиморфизам е забележан во други земји во светот). Препорачливо е да се користат овие карактеристики при анализа на збирки и составување бази на податоци на регионално и глобално ниво. Во случај на анализа на изоензими и хаплотипови на митохондријалната ДНК, можно е целосно да се направи без стандардни соеви, додека при анализата на типовите на парење потребни се два тест изолати со познати типови на парење.
Условите на реакција и реагенсите можат да влијаат само на контрастот на производот на електроферограмот. Манифестацијата на артефакти во овие типови на студии е мала.
Во моментов, поголемиот дел од популациите во европскиот дел на Русија се претставени со соеви од двата типа на парење (Табела 6), меѓу нив има изолати со типови Ia и IIa на митохондријална ДНК (други типови mtDNA пронајдени во светот не се откриени во Русија по 1993 година). Спектрите на изоензимите на пептидаза се претставени со два генотипа во локусот Pep1 (100/100, 92/92 и хетерозигот 92/100, при што генотипот 92/92 е исклучително редок (<0,3%) и два генотипа на Pep 2 локус (100/100, 112/112 и хетерозигот 100/112, а генотипот 112/112 е поретко од 100/100, но исто така доста чест).
Не е забележана варијабилност во спектарот на изоензимите на гликоза-6-фосфат изомераза (исчезнување на клоналната линија US-1993) со генотип 1/100 (Елански и Смирнов, 100).
Третата група методи овозможува да се добие доволна група на независни карактеристики на маркери со висока репродуктивност. Денес, оваа група го вклучува примерокот RFLP-RG57, кој произведува 25-29 фрагменти на ДНК со различни големини. RFLP-RG57 може да се користи и при анализа на примероци и при составување бази на податоци. Сепак, овој метод е многу поскап од претходните, бара многу време и бара прилично голема количина на високо прочистена ДНК. Затоа, истражувачот е принуден да го ограничи обемот на тестираниот материјал.
Развојот на RFLP-RG57 во раните 90-ти значително ги интензивираше популациските студии на патогенот на доцната болест. Таа стана основа на метод заснован на изолација и анализа на „клонални линии“ (види подолу). Заедно со RFLP-RG57, типот на парење, отпечатокот на ДНК (метод RFLP-RG57), спектрите на изоензимите на пептидаза и глукоза-6-фосфат изомераза и типот на митохондријална ДНК се користат за да се идентификуваат клоналните линии. Благодарение на него, беше прикажано од страна на ал., 1994), замената на старите популации со нови (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), и клоналните линии кои преовладуваат во многу земји на светот беа идентификувани. Студиите на руските соеви со користење на овој метод покажаа висок генотипски полиморфизам на соеви во европскиот дел и мономорфизам на популации во азиските и далечноисточните делови на Русија (Elansky et al, 2001). И сега овој метод останува главен при спроведување на популациони студии на P. infestans. Сепак, неговата широка употреба е попречена од неговата прилично висока цена и трудоинтензивна имплементација.
Друг ветувачки метод кој не е широко користен во истражувањето на P. infestans е анализата на микросателитски повторувања (SSR). Во моментов, овој метод е широко користен за изолирање на клонални линии. За анализа на соеви, фенотипските маркерски особини како што се присуството на вирулентни гени за сортите компири (Avdey, 1995, Ivanyuk et al., 2002, Ulanova et al., 2003) и доматот се широко користени (и продолжуваат да се користат ). До денес, вирулентните гени за сортите на компири ја изгубиле својата вредност како маркерски особини за популационите студии поради појавата на максималниот (или блиску до него) број на вирулентни гени во огромното мнозинство на изолати. Во исто време, генот на вирулентност Т1 за сорти на домати кои го носат соодветниот Ph1 ген сè уште успешно се користи како маркерска карактеристика (Lavrova et al., 2003, Ulanova et al., 2003).
Многу студии користат отпорност на фунгициди како маркерска карактеристика. Оваа особина не е препорачливо да се користи во студиите на населението поради релативно лесното појавување на мутации на отпорност во клоналните линии по примената на фунгициди кои содржат металаксил (или мефеноксам-) на теренот. На пример, значајни разлики во нивото на отпор се прикажани во рамките на клоналната лоза Sib1 (Elansky et al., 2001).
Така, претпочитаните маркерски карактеристики за создавање бази на податоци и означување соеви во збирките се типот на парење, изоензимскиот спектар на пептидаза, типот на митохондријална ДНК, RFLP-RG57, SSR. За да споредите ограничени примероци, доколку е неопходно да се користи максималниот број карактеристики на маркерите, можете да користите AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (Табела 5). Сепак, треба да се запомни дека овие методи се слабо репродуктивни и во секој поединечен експеримент (циклус на електрофореза на засилување) неопходно е да се користат неколку референтни изолати.
Табела 5. Споредба на различни методи за проучување на соеви P. Infestans
критериум | ТЦ | Изоензими | MtDNA | RFLP-RG57 | РАПД | ISSR | SSR | АФЛП | Преос |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Количина на информации | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Репродуктивност | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Можност за артефакти | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Цена | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Интензитетот на трудот | Н | Н | Н | В | НС* | НС* | Н | С | НС* |
брзина на анализа** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Забелешка: H – ниско, C – средно, V – високо; NS* - низок интензитет на трудот кога се користи гел агароза или автоматски
генотип, медиум - кога се дестилира во полиакриламид гел со означени прајмери,
** - не сметајќи го времето поминато на одгледување мицелиум за да се изолира ДНК.
Структура на населението
Клонални линии
Во отсуство на рекомбинација или нејзиниот незначителен придонес во структурата на населението, популацијата се состои од одреден број клонови, генетските размени меѓу кои се исклучително ретки.
Кај таквите популации, поинформативно е да се проучуваат не фреквенциите на поединечни гени, туку фреквенциите на генотипови кои имаат заедничко потекло (клонални лози) и се разликуваат само во точкасти мутации. Популационите студии на патогенот на доцната болест и анализата на клоналните линии значително се забрзаа од појавата на методот RFLP-RG57 во раните 90-ти на минатиот век. Заедно со RFLP-RG57, типот на парење, спектрите на изоензимите на пептидаза и глукоза-6-фосфат изомераза и типот на митохондријална ДНК се користат за да се идентификуваат клоналните линии. Карактеристиките на најчестите клонални линии се дадени во Табела 6.
Клонот US-1 доминираше со популации насекаде до крајот на 80-тите, по што почна да се заменува со други клонови и исчезна од Европа и Северна Америка. Сега се наоѓа на Далечниот Исток (Филипини, Тајван, Кина, Јапонија, Кореја, Koh et al., 1994, Mosa et al., 1993), во Африка (Уганда, Кенија, Руанда, Goodwin et al., 1994, Vega-Sanchez et al., 2000 Ochwo et al., 2002) и во Јужна Америка (Еквадор, Бразил, Перу, Forbes et al., 1997, Goodwin et al., 1994). Само во Австралија не се идентификувани соеви кои припаѓаат на лозата US-1. Очигледно, изолатите на P. infestans пристигнаа во Австралија во друг бран на миграција (Гудвин, 1997).
Клонот US-6 мигрирал од северно Мексико во Калифорнија кон крајот на 70-тите и предизвикал епидемија на компири и домати таму по 32 години отсуство на болеста. Поради својата висока агресивност, тој го замени клонот US-1 и стана доминантен на западниот брег на САД (Goodwin et al., 1995a).
Генотиповите US-7 и US-8 беа откриени во САД во 1992 година и веќе широко распространети во САД и Канада во 1994 година. Во текот на една теренска сезона, клонот US-8 е во состојба речиси целосно да го замени клонот US-1 во парцели со компир првично инфицирани со двата клона во еднакви концентрации (Miller и Johnson, 2000).
Клоните BC-1 до BC-4 беа идентификувани во Британска Колумбија во мал број изолати (Goodwin et al., 1995b). Клонот US-11 широко се рашири во Соединетите Држави и го замени US-1 во Тајван. Клоните JP-1 и EC-1, заедно со клонот US-1, се дистрибуирани во Јапонија и Еквадор, соодветно (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
СИБ-1 е клон кој преовладуваше во Русија на огромна територија од московскиот регион до Сахалин. Откриен е во московскиот регион во 1993 година, при што некои популации на терен се состојат претежно од соеви на оваа клонална линија кои се високо отпорни на металаксил. По 1993 година, преваленцата на овој клон значително се намали. Надвор од Урал во 1997-1998 година, SIB-1 беше пронајден насекаде, со исклучок на територијата Хабаровск (клонот SIB-2 е широко распространет таму). Просторното раздвојување на клоновите со различни типови на парење го исклучува сексуалниот процес на територијата на Сибир и на Далечниот Исток. Во московскиот регион, за разлика од Сибир, населението е претставено со многу клонови; речиси секој изолат има уникатен мултилокус генотип (Elansky et al., 2001, 2015). Оваа разновидност не може да се објасни само со воведувањето на габични соеви од различни делови на светот со увезен семенски материјал. Бидејќи двата типа на парење се јавуваат кај популацијата, можно е неговата разновидност да се должи и на рекомбинација. Така, во Британска Колумбија, појавата на генотипови BC-2, BC-3 и BC-4 се претпоставува поради хибридизацијата на клоновите BC-1 и US-6 (Goodwin et al., 1995b). Можно е хибридни соеви да се најдат и кај популациите во Москва. На пример, соевите MO-4, MO-8 и MO-11 хетерозиготни за локусот PEP можат да бидат хибриди помеѓу соевите MO-12, MO-21, MO-22, кои имаат тип на парење А2 и се хомозиготни за еден алел од PEP локус и сој MO-8, со тип на парење A1 и хомозиготен за друг алел на локусот. И ако тоа е така, а кај современите популации на P. infestans постои тенденција за зголемување на улогата на сексуалниот процес, тогаш информациската вредност на анализата на мултилокусните клонови ќе се намали (Elansky et al., 2001, 2015).
Варијација во клоналните лози
До 90-тите години на 20 век, клоналната линија US-1 беше широко распространета во светот. Повеќето теренски и регионални популации се состоеја исклучиво од соеви со генотип US-1. Сепак, беа забележани разлики и помеѓу изолатите, најверојатно предизвикани од мутациски процес. Мутациите се случија и во нуклеарната и во митохондријалната ДНК и влијаеја, меѓу другото, на нивото на отпорност на фениламидните лекови и на бројот на вирулентни гени. Линиите кои се разликуваат од оригиналните генотипови по мутации се означени со дополнителни броеви по точката по името на оригиналниот генотип (на пример, мутантната линија US-1.1 од клоналната линија US-1). Отпечатоците од ДНК од лозата US-1.5 и US-1.6 содржат дополнителна лоза со различни големини (Goodwin et al., 1995a, 1995b); клоналната лоза US-6.3, исто така, се разликува од US-6 со една дополнителна лоза (Goodwin, 1997, Табела 7).
При проучувањето на митохондријалната ДНК, се покажа дека само тип 1b на митохондријална ДНК е пронајден во клоналната линија US-1 (Carter et al., 1990). Меѓутоа, при испитување на соеви на оваа клонална лоза од Перу и Филипините, забележани се изолати чии типови на митохондријална ДНК се разликуваат од 1b со присуство на вметнувања и бришења (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Табела 6. Мултилокусни генотипови на некои клонални линии на P. infestans
Име | Тип на парење | Изоензими | ДНК отпечатоци од прсти | MtDNA тип | |
GPI | ПЕП | ||||
САД-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 24 + | Ib |
САД-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | - |
САД-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 24 + | - |
САД-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 24 + | - |
САД-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 24 + | - |
САД-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 24 + | IIb |
САД-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
САД-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 24 + | Ia |
САД-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
САД-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
САД-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 24 + | IIb |
САД-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | - |
САД-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 24 + | - |
САД-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
САД-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 24 + | - |
САД-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 24 + | - |
САД-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
САД-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
ЕК-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 24 + | IIа |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | IIа |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | IIа |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 24 + | IIа |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 24 + | IIа |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 24 + | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 24 + | IIа |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 24 + | IIа |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 24 + | IIа |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 24 + | IIа |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 24 + | IIа |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 24 + | IIа |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 24 + | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 24 + | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 22 + | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 23 + | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 24 + | IIа |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 24 + | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 24 + | IIа |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | IIа |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | IIа |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 24 + | IIа |
Забелешка: * – нема податоци.
Табела 7. Мултилокусни генотипови и нивните мутантни линии
Име | Тип на парење | | ДНК отпечатоци од прсти (RG57) | Белешки | |
GPI | ПЕП-1 | ||||
САД-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Оригинален генотип 1 |
САД-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Мутација во PEP |
САД-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Мутација во RG57 |
САД-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Мутација во RG57 |
САД-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Мутација во RG57 и PEP |
САД-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Мутација во RG57 |
САД-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Оригинален генотип 2 |
САД-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Мутација во PEP |
САД-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Мутација во RG57 |
САД-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Мутација во RG57 |
САД-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Мутација во RG57 и PEP |
САД-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Мутација во RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Оригинален генотип 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Мутација во RG57 |
Има промени и во спектрите на изоензимите. Како по правило, тие се предизвикани од распаѓање на организам првично хетерозиготен за овој ензим во хомозиготни. Во 1993 година, идентификувавме вид на овошје од домати со карактеристики карактеристични за US-1: отпечаток RG57, тип на митохондријална ДНК и генотип 86/100 за гликоза-6-фосфат изомераза, но тој беше хомозиготен (100/100) за првата пептидаза локус наместо хетерозиготите типични за оваа клонална линија се 92/100. Го именувавме генотипот на овој сој MO-17 (Табела 6). Мутантните линии US-1.1 и US-1.4 исто така се разликуваат од US-1 со мутации во првиот пептидазен локус (Табела 7).
Доста често се случуваат мутации кои водат до промени во бројот на вирулентни гени во сортите на компири и домати. Тие се пријавени меѓу изолатите на клоналната лоза US-1 во популации од Холандија (Drenth et al., 1994), Перу (Goodwin et al., 1995a), Полска (Sujkowski et al., 1991) и северниот северен дел Америка (Goodwin et al., 1995 ., 7b). Разлики во бројот на гени за вирулентност на компирот, исто така, беа забележани меѓу изолатите на клоналните линии US-8 и US-1995 во Канада и САД (Goodwin et al., 1a), меѓу изолатите од лозата SIB-2001 во азискиот дел на Русија (Elansky et al., XNUMX).
Изолатите со силни разлики во нивоата на отпорност на фениламидни лекови беа идентификувани во популации на моноклонални полиња, од кои сите припаѓаа на клоналната лоза Sib-1 (Elansky et al, 2001, Табела 1). Речиси сите соеви на клоналната лоза US-1 се многу подложни на металаксил, но високо отпорни изолати од оваа лоза се изолирани на Филипините (Koh et al., 1994) и во Ирска (Goodwin et al., 1996).
Модерни популации на P. infestans
Централна Америка (Мексико)
Популацијата на P. infestans во Мексико значително се разликува од другите светски популации, што првенствено се должи на неговата историска положба. Бројни студии на оваа популација и сродни видови на Phytophthora clade до P. infestans, како и локални видови од родот Solanum, доведоа до заклучок дека еволуцијата на патогенот во централно Мексико се случила заедно со еволуцијата на растенијата домаќини и беше поврзан со сексуална рекомбинација (Grünwald, Flier, 2005). Двата типа на парење се застапени во популацијата и во еднакви размери, а присуството на ооспори во почвата, на растенијата и клубени од компири и дивите сродни видови Solanum го потврдува присуството на сексуален процес кај популацијата (Fernández-Pavía et al., 2002). Неодамнешните студии во и околу долината Толука (осомничениот центар на потекло на патогенот) ја потврдија високата генетска разновидност на локалната популација P. infestans (134 мултилокусни генотипови во примерок од 176 пристапи) и присуството на неколку диференцирани субпопулации во регионот (Ванг и сор., 2017). Факторите кои придонесуваат за оваа диференцијација вклучуваат просторно раздвојување на потпопулациите карактеристични за планинските области на централно Мексико, разликите во условите за одгледување и сортите на компири што се користат во долините и планините и присуството на видовите Solanum кои носат диви клубени кои можат да дејствуваат како алтернативни домаќини. (Фрај и сор., 2009).
Сепак, треба да се забележи дека популациите на P. infestans во северно Мексико се поклонални по природа и послични на северноамериканските популации, што може да укаже на нови генотипови (Fry et al., 2009).
Северна Америка
Северноамериканските популации на P. infestans отсекогаш имале многу едноставна структура и нивниот клонален карактер бил воспоставен долго пред употребата на микросателитски анализи. До 1987 година, клоналната лоза US-1 доминираше во Соединетите Американски Држави и Канада (Goodwin et al., 1995). Во средината на 70-тите, кога станаа достапни фунгициди базирани на металаксил, овој клон почна да се заменува со други, поотпорни генотипови кои мигрираа од Мексико (Goodwin et al., 1998). До крајот на 90-тите. Генотипот US-8 целосно го замени генотипот US-1 во Соединетите Држави и стана доминантна клонална лоза во компирот (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Ситуацијата беше поинаква со доматите, каде што постојано беа присутни неколку клонални линии, а нивниот состав се менуваше од година во година (Fry et al., 2009).
Во 2009 година, во САД избувна голема епидемија на доцна лошо влијание на доматите. Особеноста на оваа пандемија беше нејзиниот речиси истовремен почеток на многу места во североисточниот дел на Соединетите Држави и беше поврзана со масовна продажба на заразени садници од домати во големите градинарски центри (Fry et al., 2013). Загубите на земјоделските култури беа огромни. Микросателитската анализа на погодените примероци откри дека пандемијата припаѓа на клоналната лоза US-22 од типот на парење А2. Во 2009 година, процентот на овој генотип во американската популација на P. infestans достигна 80% (Fry et al., 2013). Во следните години, процентот на агресивни генотипови US-23 (главно на домати) и US-24 (на компири) во популацијата постојано се зголемуваше, меѓутоа, по 2011 година, фреквенцијата на откривање на US-24 значително се намали и до денес , околу 90% од популацијата на патогенот во САД е претставена со генотипот US-23 (Fry et al., 2015).
Во Канада, како и во САД, кон крајот на 90-тите. доминантниот генотип US-1 беше заменет со US-8, чија доминантна позиција остана непоколеблива до 2008 година. Во 2009-2010 година. Во Канада, имаше сериозни епидемии на доцна лошо влијание поврзани со продажбата на заразени садници од домати, но тие беа предизвикани од генотипови US-23 и US-8 (Kalischuk et al., 2012). Забележително беше јасното географско разграничување на овие генотипови: US-23 беше доминантен во западните провинции на Канада (68%), додека US-8 беше доминантен во источните провинции (83%). Во следните години, US-23 се рашири во источните региони, но севкупно неговиот удел во населението малку се намали поради појавата на генотиповите US-22 и US-24 во земјата (Peters et al., 2014). До денес, US-23 одржува доминантна позиција низ Канада; US-8 е присутен во Британска Колумбија, а US-23 и US-24 се присутни во Онтарио (Peters, 2017).
Така, северноамериканските популации на P. infestans претставуваат првенствено клонални лоза. Во текот на изминатите 40 години, бројот на откриени клонални генотипови достигна 24. И покрај фактот што соеви од двата типа на парење се присутни во популацијата, веројатноста за појава на нови генотипови како резултат на сексуална рекомбинација останува прилично мала. Меѓутоа, во последните 20 години, забележани се неколку случаи на појава на ефемерни рекомбинантни популации (Gavino et al., 2000; Danies et al., 2014; Peters et al., 2014), а во еден случај резултатот на вкрстувањето беше генотипот US-11, кој воспостави основа во Северна Америка многу години (Gavino et al., 2000). До 2009 година, промените во структурата на популациите беа поврзани со појавата на нови, поагресивни генотипови со нивната последователна миграција и поместување на претходно доминантните претходници. Се случи во 2009-2010 година Во САД и Канада, епифитотите за прв пат покажаа дека во ерата на глобализацијата, појавата на болести може да се поврзе и со активно ширење на нови генотипови при продажба на заразен саден материјал.
Јужна Америка
До неодамна, студиите на јужноамериканските популации на P. infestans не беа ниту редовни ниту големи. Познато е дека структурата на овие популации е прилично едноставна и вклучува 1-5 клонални лоза по земја (Forbes et al., 1998). Така, до 1998 година, на компирите беа откриени генотипови US-1 (Бразил, Чиле) BR-1 (Бразил, Боливија, Уругвај, Парагвај), EC-1 (Еквадор, Колумбија, Перу и Венецуела), AR-1, AR - 2, АР-3, АР-4 и АР-5 (Аргентина), ПЕ-3 и ПЕ-7 (јужен Перу). Типот на парење А2 беше присутен во Бразил, Боливија и Аргентина и не беше пронајден подалеку од боливиско-перуанската граница во областа на езерото Титикака, надвор од кое доминираше генотипот ЕЦ-1 од типот А1 на Андите. Во доматот, US-1 остана доминантен генотип низ Јужна Америка.
Ситуацијата повеќе или помалку продолжи и во 2000-тите. Важен момент беше откривањето на новата клонална линија EC-2 од типот А2 на роднините на дивиот компир (S. brevifolium и S. tetrapetalum) во северните Анди (Oliva et al., 2010). Филогенетските студии покажаа дека оваа лоза не е целосно идентична со P. infestans, иако е тесно поврзана со неа, и затоа беше предложено да се разгледа, како и друга лоза, EC-3, изолирана од доматот S. betaceum дрво кое расте на Андите, нов вид по име P. andina; сепак, статусот на овој вид (независен вид или хибрид на P. infestans со уште непозната лоза) сè уште останува нејасен (Delgado et al., 2013).
Во моментов, сите јужноамерикански популации на P. infestans се клонални. И покрај присуството на двата типа на парење, не беа откриени рекомбинантни популации. Генотипот US-1 е сеприсутен кај доматите, очигледно поместен од компирот со локални соеви, чие точно потекло сè уште не е познато. Во Бразил, Боливија и Уругвај, генотипот BR-1 е присутен; во Перу, заедно со US-1 и EU-1, постојат неколку други локални генотипови. Во Андите, доминантната позиција ја задржува клоналната лоза EC-1, чиј однос со неодамна откриениот P. andina останува неистражен. Единственото „нестабилно“ место каде за периодот 2003-2013 г. се случија значителни промени на населението, стана Чиле (Acuña et al., 2012), каде што во 2004-2005 г. популацијата на патогенот почна да се карактеризира со отпорност на металаксил и нов хаплотип на митохондријална ДНК (Ia наместо претходно присутната Ib). Од 2006 до 2011 г во популацијата доминираше генотипот 21 (според ССР), чие учество достигна 90%, по што палмата премина на генотипот 20, чија фреквенција во следните две години остана на околу 67% (Acuña, 2015).
Европа
Во историјата на Европа имало најмалку два брана на миграција на P. infestans од Северна Америка: во 1 век. (HERB-1) и почетокот на дваесеттиот век (US-70). Широка употреба на фунгициди кои содржат металаксил во 1-тите. доведе до поместување на доминантниот US-XNUMX генотип и негова замена со нови генотипови. Како резултат на тоа, во повеќето западноевропски земји, популациите на патогените беа претставени главно со неколку клонални лоза.
Употребата на микросателитски анализи за анализа на популациите на патогените овозможи да се идентификуваат сериозните промени што се случија во Западна Европа во 2005-2008 година. според типот на парење А2005, висока агресивност и отпорност на фениламиди (Shaw et al., 13). Истиот генотип беше пронајден во примероците собрани во 2 година во Холандија и Северна Франција, што укажува на миграција во ОК од континентална Европа, веројатно преку семе од компир (Cooke et al., 13). Студијата на геномот на претставниците на оваа клонална линија покажа висок степен на полиморфизам во неговата низа (до 2 година, бројот на неговите субклонални варијации достигна 2007) и значителен степен на варијација во нивото на генска експресија, вкл. ефекторни гени за време на инфекција на растенијата (Cooke et al., 2004; Cooke, 2007). Овие карактеристики, заедно со зголеменото времетраење на биотрофичната фаза, може да предизвикаат зголемена агресивност на 2016_A340 и неговата способност да ги напаѓа дури и доцните сорти на компир отпорни на лошо влијание.
Во текот на следните неколку години, генотипот брзо се шири низ земјите од северозападна Европа (Велика Британија, Ирска, Франција, Белгија, Холандија, Германија), додека истовремено ги помести претходно доминантните генотипови 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al. ., 2010 г., Гиси и сор., 2011; Според веб-страницата www.euroblight.net, учеството на 2011_A2015 во населението на споменатите земји достигна 2017-13% и повеќе; присуството на овој генотип е забележано и во некои земји од Источна и Јужна Европа. Сепак, во 2-60 г. 80_A2009 ја загуби својата доминантна позиција во Велика Британија и Франција, отстапувајќи го местото на линијата 2012_A13 (во Ирска - 2_A6), а во Холандија и Белгија беше делумно заменета со генотипови 1_A8, 1_A1 и 1_A6 (Cooke et al., 1; , 33 Стелингверф, 2).
До денес, околу 70% од западноевропската популација на P. infestans е моноклонална. Според веб-страницата www.euroblight.net, доминантните генотипови во земјите од северозападна Европа (Велика Британија, Франција,
Холандија, Белгија) остануваат, во приближно еднакви пропорции, 13_A2 и 6_A1, а вториот практично не се наоѓа надвор од наведениот регион (со исклучок на Ирска), но веќе има најмалку 58 подклонови (Cooke, 2017). Варијациите 13_A2 се присутни во забележителен број во Германија, а спорадично се забележани и во земјите од Централна и Јужна Европа. Генотипот 1_A1 сочинува значителен дел од популацијата на Белгија и делови од Холандија и Франција. Генотипот 8_A1 е стабилизиран кај европската популација на ниво од 3-6%, со исклучок на Ирска, каде што ја задржува водечката позиција и е поделен на два субклона (Stellingwerf, 2017). Конечно, во 2016 година, забележано е зголемување на зачестеноста на појавата на новите генотипови 36_A2 и 37_A2, првпат регистрирани во 2013-2014 година; до денес, овие генотипови се наоѓаат во Холандија и Белгија и делови од Франција и Германија, како и во јужниот дел на Велика Британија (Cooke, 2017). Приближно 20-30% од западноевропското население годишно е претставено со уникатни генотипови.
За разлика од Западна Европа, до моментот кога се појави генотипот 13_A2, популациите на Северна Европа (Шведска, Норвешка, Данска, Финска) беа претставени не со клонални линии, туку со голем број уникатни генотипови (Brurberg et al.,
2011). За време на периодот на активно ширење на 13_A2 низ Западна Европа, присуството на овој генотип во Скандинавија не беше забележано дури во 2011 година, кога за прв пат беше откриен во Северна Јитланд (Данска), каде главно се одгледуваат индустриски сорти на компир со активна употреба на металаксил. -содржат фунгициди (Nielsen et al., 2014). Според www.euroblight.net, генотипот 13_A2 бил пронајден и во неколку примероци од Норвешка и Данска во 2014 година и во неколку норвешки примероци во 2016 година; Дополнително, во 2013 година, во Финска е забележано присуство на генотип 6_A1 во мали количини. Како главна причина за неуспехот на 13_A2 и другите клонални линии во освојувањето на Скандинавија се сметаат климатските разлики на овој регион од земјите од Западна Европа.
Покрај фактот што студените лета и студените зими го промовираат опстанокот на ооспорите наместо вегетативниот мицелиум (Sjöholm et al., 2013), замрзнувањето на почвата во зима (што обично не се случува во потоплите земји во Западна Европа) промовира синхронизацијата на ртење на оспорите и садење компири, што ја зајакнува нивната улога како извор на примарна инфекција (Brurberg et al., 2011). Исто така, треба да се забележи дека во северните услови, развојот на инфекција од ооспори е пред развојот на инфекција со клубени, што на крајот ја спречува доминацијата на уште поагресивни, но подоцна развиени клонални линии (Yuen, 2012). Структурата на најпроучените популации на P. infestans во источноевропските земји (Полска, балтичките земји) е многу слична со онаа во Скандинавија.
И овде, двата типа на парење се присутни и огромното мнозинство на генотипови утврдени со SSR анализа се единствени (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Како и во Северна Европа, ширењето на клоналните линии (првенствено генотипот 13_A2) практично не влијаеше на локалните популации на патогенот, кои одржуваат високо ниво на разновидност со отсуство на изразени доминантни линии.
Присуството на 13_A2 повремено е забележано на полињата со комерцијални сорти компири. Во Русија ситуацијата е слична. Микросателитска анализа на изолатите на P. infestans собрани во 2008-2011 година. во 10 различни региони на европскиот дел на Русија, покажа висок степен на генотипска разновидност и целосен недостаток на преклопување со европските клонални лози (Statsyuk et al., 2014). Неколку години подоцна, студијата на примероците на P. infestans собрани во регионот на Ленинград во 2013-2014 година покажа значајни разлики меѓу нив и генотиповите од овој регион идентификувани во претходната студија. Во двете студии, не беа пронајдени западноевропски генотипови (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
Високата генетска разновидност на источноевропските популации на P. infestans и отсуството на доминантни клонални лози во нив може да се должат на неколку причини. Прво, како и во Северна Европа, климатските услови на разгледуваните земји придонесуваат за формирање на ооспори како примарен извор на инфекција (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Второ, значителен дел од производството на компир во овие земји се одгледува на мали приватни фарми, често опкружени со шуми или други бариери за слободното движење на заразниот материјал (Chmielarz et al., 2014). По правило, компирот одгледуван во такви услови практично не се третира со хемикалии, а изборот на сорти се заснова на нивната доцна отпорност на лошо влијание, т.е. не постои селективен притисок за агресивност и отпорност на металаксил, што ги лишува отпорните генотипови, како што е 13_A2, од предности во однос на другите генотипови (Chmielarz et al., 2014). Конечно, поради малата големина на парцелите, нивните сопственици обично не практикуваат плодоред, одгледувајќи компири на исто место со години, што придонесува за акумулација на генетски разновиден инокулум (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015 Елански и сор., 2015).
Азија
До неодамна, структурата на населението на P. infestans во Азија остана релативно слабо разбрана. Беше познато дека тој беше претставен претежно со клонални линии, а влијанието на сексуалната рекомбинација врз појавата на нови генотипови беше многу мало. Така, на пример, во 1997-1998 година. во азискиот дел на Русија (Сибир и Далечниот Исток), популацијата на патогенот беше претставена со само три генотипови со доминација на генотипот SIB-1 (Elansky et al., 2001). Присуството на клонални линии на патогенот е прикажано во земји како Кина, Јапонија, Кореја, Филипините и Тајван (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Клоналната лоза US-1 доминираше на голема површина на Азија кон крајот на 90-тите - почетокот на 2000-тите. речиси насекаде почнаа да се заменуваат со други генотипови, кои, пак, отстапија место на нови. Во повеќето случаи, промените во структурата и составот на популациите во азиските земји беа поврзани со миграција на нови генотипови однадвор. Така, во Јапонија, со исклучок на генотипот JP-3, сите други јапонски генотипови кои се појавија по US-1 (JP-1, JP-2, JP-3) имаат повеќе или помалку докажано надворешно потекло (Akino et al. , 2011). Во Кина, моментално има три главни популации на патогенот, со јасни географски поделби; нема или има многу слаб проток на гени помеѓу овие популации (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Генотипот 13_A2 се појави во Кина во нејзините јужни провинции (Јунан и Сечуан) во 2005-2007 година и во 2012-1014 година. беше забележан и во североисточниот дел на земјата (Li et al., 2013b). Во Индија, 13_A2 се појави веројатно во исто време како и во Кина, најверојатно со заразени семиња од компири (Chowdappa et al., 2015), а во 2009-2010 година. предизвика сериозна појава на доцна болест на доматот на југот на земјата, по што се прошири на компирот и во 2014 година предизвика појава на доцна лошо влијание во Западен Бенгал, што доведе до пропаст и самоубиство на многу локални фармери (Фрај, 2016).
Африка
До 2008-2010 г. Немаше систематски студии за P. infestans во африканските земји. Во моментов, африканските популации на P. infestans можат да се поделат во две групи, а оваа поделба е јасно поврзана со увозот на семенски компир од Европа.
Во Северна Африка, која активно увезува семенски компир од Европа, типот на парење А2 е широко застапен во речиси сите региони, што дава теоретска можност за појава на нови генотипови како резултат на сексуална рекомбинација (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Покрај тоа, во Алжир, присуството на генотипови 13_A2, 2_A1 и 23_A1 е забележано со изразена доминација на првиот од нив, како и постепено намалување на процентот на единствени генотипови до целосно исчезнување (Rekad et al., 2017) . За разлика од остатокот од регионот, во Тунис (со исклучок на североисточниот дел на земјата) популацијата на патогенот е претежно претставена со типот на парење А1 (Harbaoui et al., 2014).
Доминантната клонална линија овде е NA-01. Општо земено, процентот на клонални линии во популацијата е само 43%. Во Источна и Јужна Африка, каде што увозот на семе е многу мал (Fry et al., 2009), P. infestans е претставена со само две клонални лоза од типот А1, US-1 и KE-1, при што второто активно го поместува првото во компири (Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). До денес, двата од овие генотипови имаат забележлива количина на субклонални варијации.
Австралија
Првиот извештај за доцна лошо влијание на компирот во Австралија датира од 1907 година, а првиот епифитот, веројатно предизвикан од обилните дождови во летните месеци, се случил во 1909-1911 година. (Drenth et al., 2002). Генерално, сепак, доцната болест не е од значајно економско значење за земјата. Спорадични епидемии на доцна лошо влијание, предизвикани од временските услови кои обезбедуваат висока влажност, се случуваат не повеќе од еднаш на секои 5-7 години и се локализирани главно во северна Тасманија и централна Викторија. Во врска со горенаведеното, практично нема публикации посветени на проучување на структурата на австралиската популација на P. infestans. Најновите достапни информации се за 1998-2000 година. (Drenth et al., 2002). Според авторите, викторијанската популација била US-1.3 клонална лоза, што индиректно ја потврдила миграцијата на овој генотип од САД. Примероците од Тасманија беа доделени на типот AU-3, различен од генотиповите присутни во тоа време во другите делови на светот.
Карактеристики на развојот на доцна лошо влијание во Русија
Во Европа, примарниот инокулум на компирот се смета за инфекција воведена со заболени клубени од семиња, ооспори презимувани во почвата, како и зооспорангија донесена од ветрот од растенија одгледувани од презимувани клубени на минатогодишните полиња („доброволни“ растенија) , или на купишта отфрлени растенија за складирање на клубени. Од нив, најопасен извор на инфекција се сметаат растенијата одгледувани на купишта отфрлени клубени, бидејќи таму бројот на никнати клубени е често значаен, а зооспорангијата од нив може да се носи на долги растојанија. Други извори (ооспори, „доброволни“ растенија) не се толку опасни, бидејќи Не е вообичаено да се одгледуваат растенија на истите полиња повеќе од еднаш на секои 3-4 години. Инфекцијата од заболените клубени од семиња е исто така минимална поради добрите системи за контрола на квалитетот на семето.
Генерално, количеството на инокулум кај европските популации е ограничено и затоа растот на епидемијата е прилично бавен и може успешно да се контролира со помош на хемиски фунгицидни лекови. Главната задача во европски услови е да се бори против инфекцијата во фазата кога започнува масовното растурање на зооспорангијата од погодените растенија.
Во Русија ситуацијата е радикално поинаква. Повеќето од посевите со компири и домати се одгледуваат во мали приватни градини; или воопшто не се спроведуваат заштитни мерки врз нив или се спроведуваат фунгицидни третмани во недоволни количини и започнуваат по појавата на доцна лошо влијание на врвовите. Како резултат на тоа, приватните градини делуваат како главен извор на инфекција од нив ветерот ги носи до комерцијалните насади. Ова е потврдено со нашите директни набљудувања во регионите на Москва, Брјанск, Кострома и Рјазан: оштетувањето на растенијата во приватните градини е забележано дури и пред почетокот на третирањето на комерцијалните насади со фунгициди. Последователно, епидемијата на големи полиња се контролира со употреба на фунгицидни лекови, додека во приватните градини има брз развој на доцна лошо влијание.
Во случај на неправилни или „буџетски“ третмани на комерцијални насади, на полињата се појавуваат фокуси на доцнење; во иднина тие активно се развиваат, зафаќајќи сè поголеми области (Елански, 2015). Инфекциите што се развиваат во приватни градини имаат значително влијание врз епидемиите во комерцијалните полиња. Во сите региони за одгледување компири во Русија, површината зафатена со компири во приватните градини е неколку пати поголема од вкупната површина на полињата на големите производители. Во такви услови, приватните градинарски градини може да се сметаат како глобален ресурс за инокулум за комерцијални полиња. Ајде да се обидеме да ги идентификуваме оние својства што се карактеристични за генотиповите на соеви во приватните градини.
Садење компири кои не поминале низ контрола на семиња и карантин, семиња од домати добиени од сомнителни странски производители, долгорочно одгледување на компири и домати на истите области, неправилно третирање со фунгициди или нивно целосно отсуство доведуваат до сериозни епифитотии во приватниот сектор, што резултира со слободно вкрстување, хибридизација и формирање на ооспори во приватните градини. Како резултат на тоа, се забележува многу висока генотипска разновидност на патогенот, кога речиси секој вид е единствен во својот генотип (Elansky et al., 2001, 2015). Садењето семенски компир од различно генетско потекло ја прави мала веројатноста дека ќе се појават клонални линии специјализирани за напад на одредена сорта. Избраните соеви во овој случај се разликуваат по нивната разновидност во однос на засегнатите сорти, повеќето од нив имаат блиску до максималниот број на вирулентни гени. Ова е многу различно од системот на „клонални линии“ типични за големи полиња на земјоделски организации со правилно инсталиран систем за заштита од доцна лошо влијание. „Клоналните линии“ (кога сите соеви на патогенот на доцната болест на теренот се претставени со еден или повеќе генотипови) се сеприсутни во земјите каде што одгледувањето компир се врши исклучиво од големи фарми: САД, Холандија, Данска итн. Англија, Ирска, Полска, каде што одгледувањето на компири е исто така традиционално вообичаено одгледување компири, има и поголема генотипска разновидност во приватните градини. „Клоналните линии“ на крајот на 20 век беа широко распространети во азиските и далечните источни делови на Русија (Elansky et al., 2001), што, очигледно, се должи на употребата на истите сорти за садење исклучиво домашно производство компири. Неодамна, ситуацијата во овие региони исто така почна да се менува кон зголемување на генотипската разновидност на популациите.
Отсуството на интензивни третмани со фунгицидни препарати има уште една, директна последица - нема акумулација на отпорни соеви во градините. Навистина, нашите резултати покажуваат дека видовите отпорни на металаксил се идентификуваат значително поретко во приватни градини отколку во комерцијални насади.
Блиската близина на насадите со компири и домати, типични за приватни градини, ја олеснува миграцијата на соеви меѓу овие култури, како резултат на што, во последната деценија, меѓу соевите изолирани од компири, процентот на соеви кои го носат генот за отпорност кон Сорти на домати од цреши (Т1), претходно карактеристични само за „соеви на домати. Видовите со генот Т1 во повеќето случаи се многу агресивни и кон компирот и кон доматите.
Во последниве години, доцната болест на доматите почна да се појавува во многу случаи порано отколку кај компирот. Изворот на инфекција на садници од домати може да бидат оспори во почвата или ооспори присутни или залепени во семето од домати (Rubin et al., 2001). Во последните 15 години во продавниците се појавија голем број евтини пакувани семиња, главно увозни, а повеќето мали производители се префрлија на нивно користење. Семињата може да содржат соеви со генотипови типични за регионите каде што се одгледуваат. Последователно, овие генотипови се вклучени во сексуалниот процес во приватни градини, што доведува до појава на сосема нови генотипови.
Така, може да се констатира дека приватните градини се глобално „топење“ во кое како резултат на размена на генетски материјал се обработуваат постоечките генотипови и се појавуваат сосема нови. Во исто време, нивниот избор се одвива под услови кои се многу различни од оние создадени за компири на големи фарми: отсуство на фунгицидно преса, сортна униформност на насадите, доминација на растенија погодени од различни форми на вирусна и бактериска инфекција, блискост со домати и диви ноќници, активно вкрстување и формирање на оспори, можност ооспорите да дејствуваат како извор на инфекција за следната година.
Сето ова води до многу висока генотипска разновидност на популациите на чифликите. Под епифитозни услови, доцната лошо влијание се шири многу брзо во градинарските градини и се ослободуваат огромни количини спори, кои летаат до блиските комерцијални насади. Меѓутоа, еднаш на комерцијални полиња со правилен систем на земјоделска технологија и хемиска заштита, спорите кои пристигнуваат практично немаат можност да иницираат епифитотија на теренот, што се должи на недостатокот на клонални линии отпорни на фунгициди специјализирани за одгледуваната сорта.
Друг извор на примарен инокулум може да бидат заболените клубени внесени во комерцијални насади со семенски материјал. Овие клубени се одгледувале, по правило, на полиња со добра земјоделска технологија и интензивна хемиска заштита. Генотиповите на изолатите кои ги зафатиле клубените се прилагодени на развојот на нивната сорта. Овие соеви се многу поопасни за комерцијални насади отколку инокулумот што потекнува од приватни градини. Резултатите од нашето истражување исто така ја поддржуваат оваа претпоставка. Популациите изолирани од големи полиња со правилно спроведена хемиска заштита и добра земјоделска технологија не се одликуваат со висока генотипска разновидност. Често тоа се неколку клонални линии кои се многу агресивни.
Видовите од комерцијален семенски материјал можат да навлезат во популации во градинарски градини и да бидат вклучени во процесите што се случуваат во нив. Меѓутоа, во зеленчукова градина, нивната конкурентност ќе биде многу пониска отколку на комерцијално поле, и наскоро тие ќе престанат да постојат во форма на клонална линија, но нивните гени може да се користат во популацијата на „градина“.
Инфекцијата што се развива на „доброволни“ растенија и на купишта клубени отфрлени за време на бербата не е толку релевантна за Русија, бидејќи Во главните региони за одгледување компири во Русија, се забележува длабоко зимско замрзнување на почвата, а растенијата од клубени презимувани во почвата ретко се развиваат. Згора на тоа, како што покажуваат нашите експерименти, патогенот на доцна лошо влијание не преживува на температури под нулата дури и на клубени кои остануваат одржливи. Во сушната зона, каде што се практикува рано одгледување на компир, доцната болест е доста ретка поради сувата и топла сезона на растење.
Така, во моментов ја набудуваме поделбата на популациите на P. infestans на „поле“ и „градинарска“ популација. Сепак, во последниве години, се забележуваат процеси кои водат кон конвергенција и интерпенетрација на генотипите од овие популации.
Меѓу нив, може да се забележи општо зголемување на писменоста на малите производители, појава на прифатливи мали пакувања со компир од семе, ширење на фунгицидни препарати во мали пакувања и губење на страв од „хемија“ од страна на населението.
Настануваат ситуации кога, благодарение на активната работа на еден добавувач, цели села се наоѓаат засадени со семе клубени од истата сорта и обезбедени со мали пакувања од истите пестициди. Сосема е можно да се претпостави дека компирите од истата сорта ќе се појават и на комерцијални насади во близина.
Од друга страна, некои компании за трговија со пестициди промовираат „евтини“ шеми за хемиски третман. Во овој случај, бројот на препорачани третмани е потценет и се нудат најевтините фунгициди, а акцентот не е ставен на спречување на развојот на доцната болест до степен на косење на врвовите, туку на одредено доцнење на епифитотијата со цел да се зголеми принос. Ваквите шеми се економски оправдани кога се одгледуваат компири од семенски материјал со низок степен, кога во принцип не станува збор за добивање висок принос. Меѓутоа, во овој случај, за разлика од градинарските популации, израмнетата генетска позадина на компирот придонесува за избор на специфични физиолошки раси, кои се многу опасни за дадена сорта.
Генерално, трендовите кон конвергенција на методите на „градина“ и „поле“ за производство на компир ни изгледаат доста опасни. За да се спречат нивните негативни последици и во домаќинството и во комерцијалниот сектор, ќе биде неопходно и да се контролира асортиманот на семенски компир и опсегот на фунгициди што им се нудат на приватните трговци во мали пакувања, и да се следат шемите за заштита на компирот и употребата на фунгицидни препарати во комерцијалниот сектор.
Во областите на приватниот сектор, постои интензивен развој не само на доцна лошо влијание, туку и на Алтернарија. Повеќето сопственици на приватни фарми не преземаат посебни мерки за заштита од Алтернарија, погрешно во развојот на Алтернарија за природно венење на зеленилото или развој на доцна лошо влијание. Затоа, со масивниот развој на Алтернарија на подложни сорти, парцелите за домаќинства можат да послужат како извор на инокулум за комерцијални насади.
Механизми на варијабилност
Процес на мутација
Бидејќи појавата на мутации е случаен процес кој се јавува со мала фреквенција, појавата на мутации на кој било локус зависи од фреквенцијата на мутации на овој локус и од големината на популацијата. При проучување на фреквенцијата на мутации на соевите на P. infestans, обично се одредува бројот на колонии кои се одгледуваат на селективни хранливи подлоги по третман со хемиски или физички мутагени. Како што може да се види од податоците презентирани во Табела 8, фреквенцијата на мутација на истиот сој на различни локуси може да се разликува за неколку реда на големина. Високата фреквенција на мутации на отпорност на металаксил може да биде една од причините за акумулација на соеви отпорни на него во природата.
Фреквенцијата на спонтани или индуцирани мутации, пресметана врз основа на лабораториски експерименти, не секогаш одговара на процесите што се случуваат во природните популации од следниве причини:
1. Со асинхрони нуклеарни поделби, невозможно е да се процени фреквенцијата на мутации по нуклеарна генерација. Затоа, повеќето експерименти обезбедуваат информации само директно за фреквенцијата на мутациите, без разлика помеѓу два мутациски настани и еден настан по митозата.
2. Мутациите во еден чекор обично ја намалуваат рамнотежата на геномот, затоа, заедно со стекнувањето ново својство, се намалува и целокупната кондиција на организмот. Повеќето експериментално добиени мутации имаат намалена агресивност и не се евидентирани кај природните популации. Така, коефициентот на корелација помеѓу степенот на отпорност на мутанти P. infestans на фениламид фунгициди и стапката на раст на вештачка средина беше во просек (-0,62), и отпорност на фунгициди и агресивност на листовите од компир (-0,65) (Derevyagina et al, 1993), што укажува на ниската кондиција на мутантите. Мутациите на отпорност на диметоморф, исто така, беа придружени со нагло намалување на одржливоста (Bagirova et al., 2001).
3. Повеќето спонтани и индуцирани мутации се рецесивни и не се манифестираат фенотипски во експериментите, туку претставуваат скриена резерва на варијабилност кај природните популации. Мутантните соеви изолирани во лабораториски експерименти носат доминантни или полудоминантни мутации (Kulish и Dyakov, 1979). Очигледно, диплоидноста на јадрата ги објаснува неуспешните обиди да се добијат мутанти под влијание на УВ зрачење кои биле вирулентни на претходно отпорните сорти (McKee, 1969). Според пресметките на авторот, таквите мутации можат да се појават со фреквенција помала од 1:500000. Преминот на рецесивни мутации во хомозиготна, фенотипски изразена состојба може да се случи поради сексуална или асексуална рекомбинација (види подолу). Сепак, дури и во овој случај, мутацијата може да се маскира со доминантни алели на јадра од див тип во сенотичниот (повеќејадрениот) мицелиум и фенотипски да се фиксира само за време на формирањето на мононуклеарни зооспори.
Табела 8. Фреквенција на мутации на P. infestans на супстанции инхибиторни на растот под влијание на нитросометилуреа (Долгова, Дјаков, 1986; Багирова и сор., 2001)
Соединение | Фреквенција на мутација |
Окситетрациклин | 6,9 10 x-8 |
Бластицидин С | X 7,2 10-8 |
Стрептомицин | 8,3 x10-8 |
Трихотецин | 1,8 10 x-8 |
Циклохексимид | 2,1 10 x-8 |
Даконил | < 4 x 10-8 |
Диметоморф | 6,3 10 x-7 |
Металаксил | 6,9 10 x-6 |
Големината на популацијата исто така игра одлучувачка улога во појавата на спонтани мутации. Во многу големи популации, во кои бројот на клетки е N>1/a, каде што a е стапката на мутација, мутацијата престанува да биде случаен феномен (Kvitko, 1974).
Пресметките покажуваат дека со просечна наезда на поле со компир (35 точки на едно растение), дневно на еден хектар се формираат 8х1012 спори (Дјаков, Супрун, 1984). Очигледно, во таквите популации сите мутации дозволени од типот на размена се случуваат на секој локус. Дури и ретка мутација која се јавува со фреквенција од 10-9 ќе ја добијат илјада поединци од милиони што живеат на еден хектар поле со компир. За мутации кои се јавуваат на поголема фреквенција (на пример, 10-6), различни мутации во пар (на два локуси истовремено) може да се појават секојдневно кај таква популација, т.е. процесот на мутација ќе ја замени рекомбинацијата.
Миграции
Два главни типа на миграција се познати за P. infestans: на кратки растојанија (во полето со компир или соседните полиња) со распрснување на зооспорангијата со воздушни струи или прскање од дожд, и на долги растојанија - со садење клубени или транспортирани плодови од домати. Првиот метод обезбедува проширување на фокусот на болеста, вториот - создавање на нови фокуси на места оддалечени од примарното.
Ширењето на инфекцијата со клубени од домати и плодови не само што придонесува за појава на болеста на нови места, туку е и главен извор на генетска разновидност на популациите. Во московскиот регион се одгледуваат компири донесени од различни региони на Русија и Западна Европа. Плодовите од домати се носат од јужните региони на Русија (регионот Астрахан, регионот Краснодар, Северен Кавказ). Семињата од домати, кои исто така можат да послужат како извори на инфекција (Рубин и сор., 2001), се увезуваат и од јужните региони на Русија, Кина, европските земји и други земји.
Според пресметките на E. Mayr (1974), генетските промени во локалната популација предизвикани од мутации ретко надминуваат 10-5 по локус, додека кај отворените популации размената поради контра-генскиот проток не е помала од 10-3 - 10-4 .
Миграцијата кај заразените клубени е одговорна за влезот на P. infestans во Европа и неговото ширење низ сите региони во светот каде што се одгледуваат компири; предизвикуваат најсериозни промени на населението. Доцната болест на компирот се појави на територијата на Руската империја речиси истовремено со нејзиното појавување во Западна Европа.
Бидејќи болеста за прв пат беше забележана во 1846-1847 година во балтичките земји и само во следните години се прошири во Белорусија и северозападните региони на Русија, нејзиното западноевропско потекло е очигледно. Првиот извор на доцна лошо влијание во Стариот свет не е толку очигледен. Хипотезата развиена од Fry et al., 1992, Fry, Goodwin, 1995, Goodwin et al., 1994 година сугерира дека паразитот дошол од Мексико најпрво во Северна Америка, каде што се раширил низ земјоделските култури, а потоа бил транспортиран во Западна Европа (Сл. 7).
Како резултат на повторено летање (ефект на двојно тесно грло), единечни клонови влегоа во Европа, чии потомци предизвикаа пандемија низ целата територија на Стариот свет, каде што се одгледуваат компири. Како доказ за оваа хипотеза, авторите ја наведуваат, прво, распространетата појава на само еден тип на парење (А1) и, второ, хомогеноста на генотиповите на проучуваните соеви од различни региони (сите според молекуларни маркери, вклучително и 2 изоензимски локуси, обрасци за отпечатоци на ДНК и структурата на митохондријалната ДНК е идентична и одговара на клонот US-1 опишан во САД). Сепак, некои податоци фрлаат сомнеж за барем некои одредби од наведената хипотеза. Анализата на митохондријалната ДНК на P. infestans, изолирана од примероци од хербариум на компири инфицирани за време на првата епифитотија од 40-тите години на 1 век, покажа дека во структурата на митохондријалната ДНК тие се разликуваат од клонот US-2001, кој, според тоа, бил на барем не единствениот извор на инфекција во Европа (Ristaino et al, XNUMX).
Ситуацијата со доцната болест повторно се влоши во 80-тите. Следниве промени се случија:
1) Просечната агресивност на населението е зголемена, што доведе, особено, до широко распространето ширење на најштетната форма на доцна лошо влијание - оштетување на ливчиња и стебла.
2) Имаше поместување во времето на појава на доцна лошо влијание на компирот - од крајот на јули до почетокот на јули, па дури и до крајот на јуни.
3) Типот на парење А2, претходно отсутен во Стариот свет, почна да се наоѓа насекаде.
На промените им претходеа два настани: широката употреба на новиот фунгицид металаксил (Schwinn и Staub, 1980) и појавата на Мексико како светски извозник на компири (Niederhauser, 1993). Во согласност со ова, изнесени се две причини за промени во популацијата: конверзија на типот на парење под влијание на металаксил (Ко, 1994) и масовно воведување на нови соеви со заразени клубени од Мексико (Фрај и Гудвин, 1995). Иако интерконверзии на типови на парење под влијание на металаксил беа добиени не само од Ко, туку и во работата спроведена во лабораторијата на Московскиот државен универзитет (Савенкова, Черепенникова-Аникина, 2002), се претпочита втората хипотеза. Заедно со појавата на вториот тип на парење, се случија сериозни промени во генотиповите на руските соеви на P. infestans, вклучително и во неутралните гени (изоензимски и RFLP локуси), како и во структурата на митохондријалната ДНК. Комплексот на овие промени не може да се објасни со дејството на металаксилот, туку имаше масовен увоз на нови соеви од Мексико, кои, како поагресивни (Kato et al., 1997), ги заменија старите соеви (US-1); , станувајќи доминантна во популациите. Промената на составот на европските популации се случи за многу краток временски период - од 1980 до 1985 година (Fry et al., 1992). На територијата на поранешниот СССР, „новите соеви“ беа откриени во колекциите од Естонија во 1985 година, односно порано отколку во Полска и Германија (Goodwin et al., 1994). Последен пат „стариот сој US-1“ во Русија беше изолиран од заразен домат во Московскиот регион во 1993 година (Долгова и сор., 1997). Исто така во Франција, „старите“ соеви беа пронајдени во насадите на домати до раните 90-ти, односно откако тие долго време исчезнаа од компирот (Leberton, Andrivon, 1998). Промените во соевите на P. infestans влијаеја на многу карактеристики, вклучувајќи ги и оние од важно практично значење и ја зголемија штетноста на доцната болест.
Сексуална рекомбинација
За да може сексуалната рекомбинација да придонесе за варијабилност, потребно е, прво, присуство на два типа на парење кај популацијата во сооднос блиску до 1:1 и, второ, присуство на почетна варијабилност кај популацијата.
Односот на видовите на парење варира во голема мера кај различни популации, па дури и во различни години во иста популација (Табели 9,10, 90). Причините за ваквите драматични промени во фреквенциите на типовите на парење кај популациите (како, на пример, во Русија или Израел во раните 2002-ти на минатиот век) се непознати, но се верува дека тоа се должи на воведувањето на поконкурентни клонови (Коен, XNUMX).
Некои индиректни податоци укажуваат на појава на сексуален процес во одредени години и во одредени региони:
1) Студиите на популации од московскиот регион покажаа дека во 13 популации во кои процентот на типот на парење А2 бил помал од 10%, вкупната генетска разновидност пресметана од три изоензимски локуси била 0,08, а во 14 популации во кои процентот на А2 надмина 30%, генетската разновидност беше двојно повисока (0,15) (Elansky et al., 1999). Така, колку е поголема веројатноста за сексуален однос, толку е поголема генетската разновидност на популацијата.
2) Односот помеѓу односот на типовите на парење во популациите и интензитетот на формирање на оспор беше забележан во Израел (Коен и сор., 1997) и во Холандија
(Flier et al., 2004). Нашите студии покажаа дека кај популациите во кои изолатите со типот на парење А2 сочинуваат 62, 17, 9 и 6%, ооспори се пронајдени во 78, 50, 30 и 15% од анализираните листови од компир (со 2 или повеќе дамки), соодветно.
Примероците со 2 или повеќе точки содржеле ооспори значително почесто од примероците со 1 место (32 и 14% од примероците, соодветно) (Apryshko et al., 2004).
Ооспорите беа значително почести во листовите од средниот и долниот слој на растенијата од компир (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) Во некои региони, откриени се уникатни генотипови, чија појава е поврзана со сексуална рекомбинација. Така, во Полска во 1989 година и во Франција во 1990 година, беа откриени соеви хомозиготни за локусот на глукоза-6.
фосфат изомераза (GPI 90/90). Бидејќи претходно само 10/90 хетерозиготи се среќавале во рок од 100 години, хомозиготноста се припишува на сексуалната рекомбинација (Sujkowski et al., 1994). Во Колумбија (САД), изолатите кои комбинираат A2 со GPI 100/110 и A1 со GPI 100/100 се вообичаени, но на крајот од сезоната 1994 (16 август и 9 септември), соеви со рекомбинантни генотипови (A1 GPI 100/110 ) беа откриени и A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) Кај некои популации од Полска (Sujkowski et al., 1994) и од Северен Кавказ (Amatkhanova et al., 2004), распределбата на локусите на ДНК за отпечатоци и локусите на алозимскиот протеин одговара на распределбата на Харди-Вајнберг, што укажува
за високиот придонес на сексуалната рекомбинација во варијабилноста на популациите. Во другите региони на Русија, не беше пронајдена кореспонденција со распределбата на Харди-Вајнберг кај популациите, но беше прикажано присуство на нерамнотежа на поврзаноста, што укажува на доминација на клоналната репродукција (Elansky et al., 1999).
5) Генетската разновидност (GST) помеѓу соеви со различни типови на парење (A1 и A2) беше помала отколку помеѓу различни популации (Sujkowski et al., 1994), што индиректно укажува на сексуални вкрстувања.
Во исто време, придонесот на сексуалната рекомбинација за различноста на населението не може да биде многу висок. Овој придонес беше пресметан за населението во регионот на Москва (Elansky et al., 1999). Според пресметките на Левонтин (1979), „рекомбинацијата, која може да произведе нови варијанти од два локуси со фреквенција што не го надминува производот на нивните хетерозиготност, станува ефективна само ако вредностите на хетерозиготноста за двата алела се веќе високи“.
Со вообичаениот однос на двата типа на парење за московскиот регион 4:1, фреквенцијата на рекомбинација ќе биде 0,25. Веројатноста дека вкрстените соеви ќе бидат хетерозиготни за два од трите проучувани изоензимски локуси во испитуваните популации беше 0,01 (2 соеви од 177). Следствено, веројатноста за појава на двојни хетерозиготи како резултат на рекомбинација не треба да го надминува нивниот производ помножен со веројатноста за вкрстување (0,25x0,02x0,02) = 10-4, т.е. сексуалните рекомбинанти обично не се вклучени во испитуваниот примерок на соеви. Овие пресметки беа направени за популации од московскиот регион, кои се карактеризираат со релативно висока варијабилност. Кај мономорфните популации како сибирските, сексуалниот процес, дури и ако се јавува кај поединечни популации, не може да влијае на нивната генетска разновидност.
Покрај тоа, P. infestans се карактеризира со чести нарушувања на сегрегацијата на хромозомите во мејозата, што доведува до анеуплоидија (Carter et al., 1999). Ваквите нарушувања ја намалуваат плодноста на хибридите.
Парасексуална рекомбинација, конверзија на митотични гени
Во експериментите за спојување на соеви на P. infestans со мутации на отпорност на различни инхибитори на растот, откриена е појава на изолати отпорни на двата инхибитори (Shattock, Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Видовите отпорни на два инхибитори на раст настанале како резултат на хетерокариотизација на мицелиумот, и во овој случај биле поделени за време на репродукцијата со мононуклеарни зооспори (Judelson, Ge Yang, 1998), или не биле поделени во потомството монозооспори, бидејќи имале тетраплоиди (пошто оригиналните изолати се диплоидни) јадра (Kulish, Dyakov, 1979). Хетерозиготните диплоиди се сегрегираат на многу ниска фреквенција поради хаплоидизација, недисјункција на хромозомите и митотична вкрстување (Poedinok et al., 1982). Фреквенцијата на овие процеси може да се зголеми со одредени ефекти врз хетерозиготните диплоиди (на пример, УВ зрачење на спорите кои ртат).
Иако формирањето на вегетативни хибриди со двојна отпорност се случува не само ин витро, туку и кај клубени од компир инфицирани со мешавина од мутанти (Kulish et al., 1978), доста е тешко да се процени улогата на парасексуалната рекомбинација во генерирањето на нови генотипови во популациите. Фреквенцијата на формирање на сегреганти поради хаплоидизација, недисјункција на хромозомот и митотична вкрстување без посебни влијанија е занемарлива (помалку од 10-3).
Појавата на хомозиготни сегреганти на хетерозиготните соеви може да се заснова и на митотичко вкрстување и на митотична генска конверзија, која кај P. sojae се јавува со фреквенција од 3 x 10-2 до 5 x 10-5 по локус, во зависност од сојот ( Chamnanpunt et al., 2001).
Иако фреквенцијата на појава на хетерокариони и хетерозиготни диплоиди се покажа како неочекувано висока (достигнувајќи десетици проценти), овој процес се случува само кога мутантните култури добиени од истиот вид се споени. Кога се користат различни соеви изолирани од природата, хетерокариотизацијата не се јавува (или се јавува со многу мала фреквенција) поради присуството на вегетативна некомпатибилност (Poedinok, Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002 ). Следствено, улогата на парасексуалната рекомбинација може да се сведе само на интраклонална рекомбинација во хетерозиготните јадра и транзицијата на поединечните гени во хомозиготна состојба без сексуалниот процес. Овој процес може да биде од епидемиолошко значење кај соеви кои имаат рецесивна или полудоминантна мутација на отпорност на фунгициди. Нејзината транзиција во хомозиготна состојба како резултат на парасексуалниот процес ќе го зголеми отпорот на носителот на мутацијата (Долгова, Дјаков, 1986).
Генска интрогресија
Хетероталните видови Phytophthora се способни да се вкрстуваат за да формираат хибридни ооспори (види Воробиова и Гриднев, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Природен хибрид од два вида Phytophthora беше толку агресивен што уништи илјадници евлии во Велика Британија (Brasier et al., 1999). P. infestans може да се појави со други видови од родот (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum, итн.) на обичните растенија домаќини и во почвата, но во литературата има малку информации за можноста за појава на меѓуспецифични хибриди . Хибридите помеѓу P. infestans и P. Mirabilis се добиени во лабораториски услови (Goodwin and Fry, 1994).
Табела 9. Пропорција на соеви на P. infestans со тип на парење А2 во различни земји во светот во периодот од 1990 до 2000 година (според извори на отворена литература и веб-страници www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Земја | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Белорусија | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Белгија | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Еквадор | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Естонија | 8 (12) | ||||||||||
Англија | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Финска | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Франција | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Унгарија | 72 (32) | ||||||||||
Ирска | 4 (145) | ||||||||||
Север Ирска | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Холандија | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Норвешка | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Перу | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Полска | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Шкотска | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Шведска | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Велс | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Кореја | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Кина | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Колумбија | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Уругвај | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Мароко | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Мексико (Толука) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Табела 10. Пропорција на соеви на P. infestans со тип на парење А2 во различни земји во светот од 2000 до 2011 година
Земја | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Австрија | 65 (83) | ||||||||||
Белорусија | 42 (78) | ||||||||||
Белгија | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Швајцарија | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Германија | 95 (53) | ||||||||||
Данска | 48 (52) | ||||||||||
Еквадор | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Естонија | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Англија | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Финска | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Франција | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Унгарија | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Север Ирска | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Холандија | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Норвешка | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Перу | 0 (36) | ||||||||||
Полска | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Шкотска | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Шведска | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Словачка | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Велс | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Кореја | 46 (26) | ||||||||||
Бразил | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Кина | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Виетнам | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Уганда | 0 (8) |
Динамика на генотипскиот состав на популациите
Промените во генотипскиот состав на популациите на P. infestans може да настанат под влијание на миграцијата на нови клонови од други региони, земјоделските практики (промена на сорти, употреба на фунгициди) и временските услови. Надворешните влијанија различно влијаат на клоновите во различни фази од животниот циклус, затоа, популациите се подложени на годишни циклични промени во фреквенциите на гените кои се предмет на селекција, поради промената во доминантната улога на генетскиот дрифт и селекција.
Ефект на разновидноста
Новите сорти со ефективни гени за вертикална отпорност (R-гени) се моќен селективен фактор кој избира клонови со комплементарни вирулентни гени во популациите на P. infestans. Ако сортата на компир нема неспецифична отпорност која го инхибира растот на популацијата на патогенот, процесот на менување на доминантните клонови во популацијата се случува многу брзо. Така, по ширењето на сортата Домодедово, која го има генот за отпорност R3, во регионот на Москва, фреквенцијата на вирулентни клонови за оваа сорта се зголемила од 0,2 на 0,82 за една година (Дјаков, Деревјагина, 2000).
Сепак, промените во фреквенциите на вирулентните гени (патотипови) во популациите се случуваат не само под влијание на култивираните сорти на компири. На пример, во Белорусија, до 1977 година, доминираа клоновите со вирулентни гени 1 и 4, што беше предизвикано од одгледување на сорти на компир со гени за отпорност R1 и R4 (Дорожкин и Белскаја, 1979). Сепак, на крајот на 70-тите години на дваесеттиот век, се појавија клонови со различни вирулентни гени и нивни комбинации, а нивните комплементарни гени за отпор никогаш не биле користени во одгледувањето компири (екстра вирулентни гени) (Ivanyuk et al., 2002). Причината за појавата на ваквите клонови очигледно се должи на миграцијата на заразен материјал од Мексико со клубени од компир во Европа. Дома, овие клонови се развиле не само на култивирани компири, туку и на диви видови кои носат различни гени за отпорност, така што комбинацијата на многу вирулентни гени во геномот била неопходна за опстанок во тие услови.
Што се однесува до сортите со неспецифична отпорност, тие, со намалување на стапката на репродукција на патогенот, ја одложуваат еволуцијата на неговите популации, што, како што веќе беше споменато, е функција на бројки. Бидејќи агресивноста е полигена, клоновите кои содржат поголем број на „агресивни“ гени се акумулираат колку побрзо, колку е поголема големината на популацијата. Затоа, високоагресивните раси не се производ на адаптација на култивирани сорти со неспецифична отпорност, туку, напротив, се откриени во насади на високо чувствителни сорти, кои се акумулатори на спори на паразити.
Така, во Русија, најагресивните популации на P. infestans беа пронајдени во зони на годишни епифитоти (популации од регионите Сахалин, Ленинград, Брјанск). Се покажа дека агресивноста на овие популации е поголема од мексиканската (Филипов и сор., 2004).
Покрај тоа, помалку ооспори се формираат во лисјата на отпорните сорти отколку кај осетливите (Хансон и Шаток, 1998), односно неспецифичната отпорност на сортата, исто така, ги намалува способностите за рекомбинација на паразитот и можноста за алтернативни методи на презимување.
Ефект на фунгициди
Фунгицидите не само што го намалуваат бројот на фитопатогени габи, т.е. влијае на квантитативните карактеристики на нивните популации, но може да ги промени и фреквенциите на одделните генотипови, т.е. влијаат на квалитативниот состав на популациите. Меѓу најважните показатели за популациите кои се менуваат под влијание на фунгицидите се следните: промени во отпорноста на фунгицидите, промени во агресивноста и вирулентноста и промени во репродуктивните системи.
Влијанието на фунгицидите врз отпорноста и агресивноста на популациите
Степенот на таквото влијание се определува, пред сè, од типот на употребениот фунгицид, кој може да се подели на мулти-локациски, олиго-локациски и моно-локациски.
Првите вклучуваат повеќето контактни фунгициди. Отпорот кон нив (ако е воопшто возможен) е контролиран од голем број на многу слабо изразени гени. Овие својства го одредуваат отсуството на видливи промени во отпорноста на населението по неговото третирање со фунгициди (иако во некои експерименти е добиено мало зголемување на отпорноста). Популацијата на габи зачувана по прскање со контактни фунгициди се состои од две групи на соеви:
1) Соеви зачувани во области на растенија кои не се третирани со лекот. Бидејќи немало контакт со фунгицидот, агресивноста и отпорноста на овие соеви не се менуваат.
2) Соеви кои дошле во контакт со фунгицид, чија концентрација на точките на допир била под смртоносна. Како што споменавме погоре, отпорот на овој дел од популацијата исто така не се менува, но поради делумното штетно дејство на фунгицидот, дури и во сублетални концентрации, врз метаболизмот на габичната клетка, целокупната кондиција и нејзината паразитска компонента - агресивност - намалување (Derevyagina, Dyakov, 1990).
Така, дури и немртов дел од популацијата изложен на контакт со фунгицидот има слаба агресивност и не може да биде извор на епифитотија. Затоа, внимателен третман, кој ја намалува зачестеноста на процентот на популацијата што не е во контакт со фунгицидот, е услов за успех на заштитните мерки. Отпорноста на олигозитни фунгициди е контролирана од неколку адитивни гени.
Мутацијата на секој ген доведува до мало зголемување на отпорноста, а вкупниот степен на отпор се одредува со додавање на такви мутации. Затоа, зголемувањето на отпорот се јавува во фази. Пример за постепено зголемување на отпорноста се мутациите на отпорноста на фунгицидот диметоморф, кој широко се користи за заштита на компирот од доцна лошо влијание. Отпорот на диметоморф е полигенски и адитивен. Мутација во еден чекор малку го зголемува отпорот.
Секоја следна мутација ја намалува големината на целта и, следствено, фреквенцијата на следните мутации (Bagirova et al., 2001). Зголемувањето на просечната отпорност на населението по повторени третмани со фунгицид на олигозит се јавува постепено и постепено. Брзината на овој процес се определува од најмалку три фактори: фреквенцијата на мутации на гените за отпор, коефициентот на отпор (односот на смртоносната доза на отпорниот вид во однос на чувствителниот) и ефектот на мутациите на гените за отпорност врз фитнес.
Фреквенцијата на појавување на секоја наредна мутација е помала од претходната, па процесот е атенуиран (Bagirova et al., 2001). Меѓутоа, ако се појават процеси на рекомбинација (сексуални или парасексуални) кај популацијата, тогаш е можно да се комбинираат различни мутации на родителите во хибриден вид и да се забрза процесот. Затоа, популациите на панмикс стекнуваат отпор побрзо од агамичните, а кај вторите, популациите кои немаат бариери на вегетативна некомпатибилност, побрзо од популациите поделени со такви бариери. Во овој поглед, присуството во популациите на соеви кои се разликуваат во типовите на парење го забрзува процесот на стекнување отпорност на олигозитни фунгициди.
Вториот и третиот фактор не придонесуваат за брза акумулација на соеви отпорни на диметоморф во популациите. Секоја следна мутација приближно го удвојува отпорот, што е незначително, а во исто време ја намалува и стапката на раст во вештачка средина и агресивноста (Bagirova et al., 2001; Stem and Kirk, 2004). Ова е можеби причината зошто меѓу природните соеви на P. infestans, дури и оние собрани од насади со компир третирани со диметоморф, практично нема отпорни.
Популацијата третирана со олигозитен фунгицид, исто така, ќе се состои од две групи на соеви: оние кои не биле во контакт со фунгицидот и затоа не ги промениле почетните карактеристики (ако се најдат резистентни соеви кај оваа група, тие нема да се акумулираат поради поголема агресивност и конкурентност на чувствителните соеви) и соеви изложени на сублетални концентрации на фунгицидот. Меѓу последните е можна акумулација на отпорни соеви, бидејќи тука тие имаат предности во однос на чувствителните.
Затоа, при употребата на олигозитни фунгициди, она што е важно не е толку внимателен третман, колку висока концентрација на лекот, неколку пати поголема од смртоносната доза, бидејќи со постепено мутагенеза почетната отпорност на мутираните соеви е мала.
Конечно, мутациите на отпорност на монозитни фунгициди се многу експресивни, што значи дека една мутација може да даде високи нивоа на отпор до целосно губење на чувствителноста. Затоа, зголемувањето на отпорноста на населението се случува многу брзо.
Примери за такви фунгициди се фениламидите, вклучувајќи го и најчестиот фунгицид металаксил. Мутациите на отпорност кон него се случуваат со висока фреквенција, а степенот на отпор кај мутантите е многу висок - тој го надминува чувствителниот вид за илјада или повеќе пати (Derevyagina et al., 1993). Иако стапката на раст и агресивноста на резистентните мутанти се намалуваат наспроти позадината на смртта на чувствителните соеви од системски фунгицид, бројот на резистентна популација рапидно расте и, во исто време, нејзината агресивност се зголемува. Затоа, по неколку години користење на фунгицид, агресивноста на отпорните соеви не само што може да се изедначи со агресивноста на чувствителните соеви, туку дури и да ја надмине (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Ефект врз сексуалната рекомбинација
Бидејќи честото појавување на типот на парење А2 кај популациите на P. infestans се совпадна со интензивната употреба на металаксил против доцна лошо влијание, беше предложено дека металаксилот предизвикува конверзија на типовите на парење. Кај видот P. parasitica, ваквата конверзија под влијание на хлоронеб и металаксил е докажана експериментално (Ко, 1994). Еден премин на средина со ниска концентрација на металаксил доведе до појава на хомотални изолати од металочувствителен вид на P. infestans со парење од типот А1 (Савенкова, Черепникова-Аникина, 2002). За време на последователните премини на медиуми со поголема концентрација на металаксил, не беше можно да се открие единечен изолат со типот на парење А2, меѓутоа, повеќето изолати, кога беа вкрстени со A2 изолати, наместо ооспори, формираа грди групи на мицелиум и беа стерилни. . Премин на отпорен сој со парење тип А2 на медиуми со висока концентрација на металаксил овозможија да се детектираат три форми на промени во типот на парење: 1) целосна стерилност при вкрстување со изолатите А1 и А2; 2) хомотализам (формирање на ооспори во монокултурата); 3) конверзија на типот на парење А2 во А1. Така, металаксилот може да биде причина за промени во типовите на парење кај популациите на P. infestans и, следствено, појава на сексуална рекомбинација кај нив.
Ефект врз вегетативната рекомбинација
Некои гени за отпорност на антибиотици ја зголемија фреквенцијата на хетерокариотизација на хифи и диплоидизација на јадрата (Poedinok и Dyakov, 1981). Како што беше забележано претходно, хетерокариотизацијата на хифите за време на фузија на различни соеви на P. infestans се јавува многу ретко поради феноменот на вегетативна некомпатибилност кај оваа габа. Сепак, гените за отпорност на некои антибиотици може да имаат несакани ефекти кои резултираат со надминување на вегетативната некомпатибилност. Генот за отпорност на стрептомицин на мутантот 1S-1 го имаше ова својство. Присуството на такви мутанти во полските популации на Phytophthora може да го зголеми протокот на гените помеѓу соевите и да ја забрза адаптацијата на целата популација на нови сорти или фунгициди.
Некои фунгициди и антибиотици може да влијаат на фреквенцијата на митотичната рекомбинација, што исто така може да ја промени фреквенцијата на генотиповите кај популациите. Широко користениот фунгицид беномил се врзува за бета-тубулинот, протеинот од кој се изградени микротубулите на цитоскелетот и со тоа ги нарушува процесите на сегрегација на хромозомите во анафазата на митозата, зголемувајќи ја фреквенцијата на митотична рекомбинација (Хасти, 1970).
Истото својство го има и фунгицидот пара-флуорофенилаланин, кој се користи за лекување на брест од холандска болест. Пара-флуорофенилаланин, исто така, ја зголеми фреквенцијата на рекомбинација во хетерозиготните диплоиди на P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Циклични промени во генотипскиот состав на популациите во животниот циклус на P. infestans
Класичниот циклус на развој на P. infestans во умерената зона се состои од 4 фази.
1) Фаза на експоненцијален пораст на населението (полициклична фаза) со кратки генерации. Оваа фаза обично започнува во јули и трае 1,5-2 месеци.
2) Фаза кога растот на населението запира поради нагло намалување на процентот на незасегнатото ткиво или појава на неповолни временски услови. Во фармите кои вршат рано отстранување пред жетвата на врвовите, оваа фаза е надвор од годишниот циклус.
3) Фаза на презимување кај клубени, придружена со значително намалување на големината на популацијата поради случајна инфекција на клубени, бавен развој на инфекција во нив, отсуство на повторна инфекција на клубени во нормални услови на складирање, гниење и фрлање на погодените клубени .
4) Фаза на бавен развој во почвата и на садници (моноциклична фаза), во која времетраењето на создавањето може да достигне еден месец или повеќе (крајот на мај - почетокот на јули). Обично во ова време, заболените лисја тешко се откриваат дури и со посебни набљудувања.
Фаза на експоненцијален раст на населението (полициклична фаза)
Бројни опсервации (Пшедецкаја, Козубова, 1969; Борисенок, 1969; Оша, 1969; Дјаков, Супрун, 1984; Рибакова, Дјаков, 1990) покажаа дека на почетокот на епифитотијата, ниско-вирулентни и слабо заменети, а подоцна се заменети од повирулентни и поагресивни, Згора на тоа, стапката на раст на популациската агресивност е поголема, толку помалку отпорна е сортата на растението домаќин.
Како што расте популацијата, се зголемува концентрацијата и на селективно важните гени внесени во комерцијалните сорти (R1-R4) и на селективно неутралните (R5-R11). Така, во популациите во близина на Москва во 1993 година, просечната вирулентност од крајот на јули до средината на август се зголемила од 8,2 на 9,4, при што најголем пораст е забележан за селективно неутралниот вирулентен ген R5 (од 31 до 86% од вирулентните клонови) (Смирнов, 1996 година).
Намалувањето на стапката на раст на населението е придружено со намалување на паразитската активност на населението. Затоа, во депресивните години, и вкупниот број на раси и процентот на високо вирулентни раси се помали отколку во епифитотичните години (Борисенок, 1969). Ако, во екот на епифитотијата, временските услови се променат во неповолни за доцна лошо влијание и наездата на компирот се намалува, тогаш се намалува и концентрацијата на високо вирулентни и агресивни клонови (Rybakova et al., 1987).
Зголемувањето на фреквенцијата на гените кои влијаат на вирулентноста и агресивноста на популацијата може да се должи на изборот на повирулентни и поагресивни клонови во мешана популација. За да се демонстрира селекција, развиен е метод за анализа на неутрални мутации и успешно се користи во популации на хемостати на квасец (Adams et al., 1985) и Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Фреквенцијата на мутанти отпорни на бластицидин S во поленската популација на P. infestans се намали паралелно со зголемувањето на агресивноста на популацијата, што укажува на промена на доминантните клонови во процесот на раст на популацијата (Rybakova et al., 1987) .
Фаза на презимување кај клубени
За време на презимувањето кај клубени од компир, вирулентноста и агресивноста на соевите P. infestans се намалуваат, а намалувањето на вирулентноста се случува побавно отколку во агресивноста (Rybakova, Dyakov, 1990). Очигледно, под услови кои промовираат брз раст на популацијата (r-селекција), „екстра“ вирулентни гени и висока агресивност се покажаа како корисни, затоа развојот на епифитотијата е придружен со избор на најавирулентни и агресивни клонови. Во услови на заситеност на околината, кога не е стапката на репродукција која игра главна улога, туку истрајноста на постоење во неповолни услови (К-селекција), „екстра“ вирулентни гени и агресивност ја намалуваат кондицијата, а клоновите кои ги имаат овие гените први изумираат, така што просечната агресивност и вирулентноста на популацијата се намалува.
Вегетативна фаза во почвата
Оваа фаза е најмистериозната во животниот циклус (Andrivon, 1995). Неговото постоење се претпоставува чисто шпекулативно - поради недостаток на информации за тоа што се случува со патогенот во подолг временски период (понекогаш и повеќе од еден месец) - од појавата на садници од компир до појавата на првите точки на болеста на нив. Врз основа на набљудувања и експерименти, однесувањето на габата во овој период од животот беше реконструирано (Хирст, Стедман, 1960; Богуславскаја, Филипов, 1976).
Спорулацијата на габата може да се формира на заразените клубени во почвата. Добиените спори 'ртат со хифи, кои можат да вегетираат во почвата долго време. Примарни (формирани на клубени) и секундарни (на мицелиум во почвата) спори се издигнуваат на површината на почвата со капиларни струи, но стекнуваат способност да го инфицираат компирот само откако нивните долни лисја ќе се спуштат и ќе дојдат во контакт со површината на почвата. Таквите лисја (имено, на нив се наоѓаат првите точки на болеста) не се формираат веднаш, туку по долгорочен раст и развој на врвовите на компирот.
Така, фазата на сапротрофна вегетација може да постои и во животниот циклус на P. infestans. Ако во паразитската фаза од животниот циклус, агресивноста е најважната компонента на фитнесот, тогаш во сапротрофичната фаза селекцијата е насочена кон намалување на паразитските својства, како што е експериментално прикажано за некои фитопатогени габи (види Карсон, 1993). Затоа, во оваа фаза од циклусот, најинтензивно треба да се губат агресивните својства. Но, досега не се спроведени директни експерименти за да се потврдат направените претпоставки.
Сезонските промени влијаат не само на патогените својства на P. infestans, туку и на отпорноста на фунгицидите, која се зголемува во полицикличната фаза (за време на епифитотиите) и се намалува за време на зимското складирање (Derevyagina et al., 1991; Kadish, Cohen, 1992). Посебно интензивен пад на отпорноста кон металаксил е забележан во периодот помеѓу садењето на зафатените клубени и појавата на првите точки на болеста на теренот.
Интраспецифична специјализација и нејзината еволуција
P. infestans предизвикува епидемии кај две комерцијално важни култури, компирот и доматот. Епифитотите на компирите започнале набргу откако габата навлегла во нови области. Поразот на доматот беше забележан и веднаш по појавата на инфекцијата на компирот, но епифитотите на доматите беа забележани само сто години подоцна - во средината на дваесеттиот век. Вака пишуваат за поразот на доматите во САД од Галегли и Нидерхаузер
(1962): „Околу 100 години по тешката епифитотија од 1845 година, беше направен мал или никаков обид да се развијат отпорни сорти на домати. Иако доцната болест првпат била забележана на доматите во далечната 1848 година, таа не станала предмет на сериозно внимание на одгледувачите на ова растение сè до тешката појава на болеста во 1946 година. Во Русија, доцната болест на доматите е регистрирана уште во 60 век. „Долго време, истражувачите не обрнуваа внимание на оваа болест, бидејќи не предизвика значителна економска штета. Но, во 70-1979-тите. Во XNUMX век, епифитотии на доцна лошо влијание на доматите биле забележани и во Советскиот Сојуз, главно во регионот Долна Волга, Украина, Северен Кавказ и Молдавија...“ (Балашова, XNUMX).
Оттогаш, лозата на доматите стана годишна појава, која се шири низ целата индустриска и домашна одгледувачка област и предизвикува огромна економска штета на оваа култура. Што се случи? Зошто првото појавување на паразитот на компирот и епифитичното оштетување на оваа култура се случило речиси истовремено, додека бил потребен еден век за да се случи епифитотично оштетување на доматот? Овие разлики фаворизираат мексикански наместо јужноамерикански извор на инфекција. Ако видот Phytophthora infestans се формирал како паразит на мексиканските туберозни видови од родот Solanum, тогаш јасно е зошто култивираните компири, кои припаѓаат на истиот дел од родот како и мексиканскиот вид, биле толку сериозно погодени, но поради недостатокот на коеволуција со паразитот, тие не развија механизми на специфичен и неспецифичен отпор.
Доматот припаѓа на различен дел од родот, видот на неговиот метаболизам значително се разликува од туберозните видови, па затоа, и покрај фактот што доматот не е надвор од специјализацијата за храна на P. infestans, интензитетот на неговото оштетување беше недоволен за предизвика сериозни економски загуби.
Појавата на епифитотии на доматот се должи на сериозни генетски промени кај паразитот, кои ја зголемуваат неговата кондиција (патогеност) при паразитизам. Ние веруваме дека новата форма, специјализирана за паразитизам на домати, е расата Т1 опишана од М. Галегли, која ги инфицира сортите на домати од цреши (Црвена цреша, Отава), отпорни на расата Т0 вообичаена кај компирот (Gallegly, 1952). Очигледно, мутацијата (или серијата мутации) што ја претвори трката Т0 во трка Т1 доведе до појава на клонови високо прилагодени на оштетувањето на доматите. Како што често се случува, зголемувањето на патогеноста на еден домаќин беше придружено со негово намалување на друг, односно се појави почетна, сè уште нецелосна, интраспецифична специјализација - за компири (раса Т0) и домати (раса Т1).
Кои докази ја поддржуваат оваа претпоставка?
- Појава на компири и домати. На листовите од домати преовладува расата Т1, додека на листовите од компирот е ретка. Според С.Ф.Багирова и Т.А. Орешонкова (не е објавено) во Московскиот регион во 1991-1992 година, појавата на расата Т1 во насадите на компири била 0%, а кај насадите на домати - 100%; во 1993-1995 година – 33% и 90%, соодветно; во 2001 година – 0% и 67%. Слични податоци се добиени во Израел (Коен, 2002). Експериментите со инфекција на клубени од компир со изолати од расата Т1 и мешавина од изолати Т0 и Т1 покажаа дека изолатите на расата Т1 се слабо зачувани во клубени и се заменети со изолати од расата Т0 (Дјаков и сор., 1975; Рибакова, 1988). .
2) Динамика на расата Т1 во насадите на домати. Примарната инфекција на листовите на доматот се врши со изолати од расата Т0, кои доминираат во анализата на инфекцијата во првите дамки формирани на листовите. Ова го потврдува општо прифатениот модел на миграција на паразитот: главното тело на инфекција од компирот е расата Т0, меѓутоа, мал број клонови на расата Т1 зачувани во компирот, еднаш на домат, ја менуваат расата Т0 и се акумулираат кон крајот на епифитотијата. Исто така, можно е да постои алтернативен извор на инфекција на лисјата од домати со расата Т1, не толку моќен како клубени и лисја од компир, но постојан. Затоа, овој извор има мало влијание врз генетската структура на популацијата што инфицира домати, но последователно ја одредува акумулацијата на расата Т1 (Рибакова, 1988; Дјаков и сор., 1994).
3) Агресивност кон компири и домати. Вештачката инфекција на листовите од домати и компири со изолати на расите Т0 и Т1 покажа дека првите се поагресивни за компирите отколку за доматите, а вторите се поагресивни за доматите отколку за компирите. Овие разлики се манифестираат во поместување на изолати од различна раса од мешана популација за време на премини на лисја во стаклена градина (Дјаков и сор., 1975) и на терени (Leberton et al., 1999); разлики во минималното инфективно оптоварување, периодот на латентност, големината на заразните точки и производството на спори (Рибакова, 1988; Дјаков и сор., 1994; Легард и сор., 1995; Форбс и сор., 1997; Ојарзун и сор., 1998; Лебертон и сор., 1999 година, Вега-Санчез и други, 2000 година;
Агресивноста на изолатите на расата Т1 кон сортите домати кои немаат гени за отпорност е толку висока што овие изолати се спорулираат на листовите како на хранлив медиум без да го некротизираат заразеното ткиво (Дјаков и сор., 1975; Вега-Санчез и сор., 2000 г. ).
4) Вирулентност за компири и домати. Расата Т1 ги инфицира сортите на чери домати кои имаат ген за отпорност на Ph1, додека расата Т0 не е способна да ги зарази овие сорти, т.е. има потесна вирулентност. Во однос на диференцијаторите
Компир R гените покажуваат обратна врска, т.е. соевите изолирани од листовите на доматот се помалку вирулентни од соевите „компир“ (Табела 11).
5) Неутрални маркери. Повеќенасочната интраспецифична селекција е потврдена и со анализа на неутрални маркери кај популациите на P. infestans кои паразитираат компир и домати. Во бразилските популации на P. infestans, изолатите од листовите на доматот припаѓале на клоналната лоза US-1, а од листовите на компирот на лозата BR-1 (Suassuna et al., 2004). Во Флорида (САД), од 1994 година, клонот US-90 почна да доминира на компирот (повеќе од 8% појава), а на доматот, клоновите US-11 и US-17, а изолатите од вториот се поагресивни за доматите отколку за компири (Weingartner, Tombolato, 2004). Значајни разлики во генотипните фреквенции (отпечатоци од ДНК од прсти) помеѓу изолатите од компир и домати беа утврдени за 1200 соеви на P. infestans собрани во САД од 1989 до 1995 година (Deahl et al., 1995).
Употребата на методот AFLP овозможи да се издвојат 74 соеви собрани од листови од компир и домати во 1996-1997 година. во Франција и Швајцарија, во 7 групи. Видовите на компир и домати не се разминуваа јасно, но се покажа дека видовите „компир“ се генетски поразновидни од соевите „домат“. Првите беа пронајдени во сите седум кластери, а вторите - само во четири, што укажува на поспецијализиран геном на вториот (Кнапова и Гиси, 2002).
6) Механизми за изолација. Ако популациите на паразити на два вида растителни домаќини еволуираат во насока на стеснување на специјализацијата кон „нивниот“ домаќин, тогаш се појавуваат различни пред- и пост-мејотски механизми кои ја спречуваат интерпопулациската генетска размена (Дјаков и Лекомцева, 1984).
Неколку студии го испитуваа влијанието на изворот на родителските соеви врз ефикасноста на хибридизацијата. При вкрстување на соеви изолирани од различни видови од родот Solanum во Еквадор (Oliva et al., 2002), беше откриено дека соевите со типот на парење А2 од дивите Solanaceae (клонална линија EC-2) најлошо се вкрстуваат со соеви од домати ( линија EC -3), и најефективно се вкрстуваат со сој од компир (EC-1).
Сите хибриди се покажаа како непатогени. Авторите веруваат дека нискиот процент на хибридизација и намалувањето на патогеноста кај хибридите се должат на постмејотичните механизми на репродуктивна изолација на популациите.
Во експериментите на Багирова и сор. Најплодни беа вкрстувањата на соеви T1998xT0 изолирани од домати (1 ооспори во видното поле на микроскопот, 1% ртење на ооспорот), најмалку ефективни беа вкрстувањата на T1xT36 раси изолирани од различни домаќини (мал број на формирани и ртени ооспори, висок процент на абортирани и неразвиени ооспори). Ефективноста на вкрстувањата помеѓу Т44 расните изолати изолирани од компири се покажа како средна. Бидејќи главната низа на соеви на расата Т0 ги инфицира компирите, таа има сигурен извор на презимување - клубени од компири, како резултат на што важноста на ооспорите како презимувачки заразни единици за популацијата на компирот е мала. Прилагодената „доматна форма“ може да презимува на доматите во форма на ооспори (види подолу) и затоа одржува поголема продуктивност на сексуалниот процес. Поради високата плодност, Т1 стекнува независен потенцијал за примарна инфекција на доматот. Резултатите добиени од Кнапова и сор. (0) можат да се толкуваат на ист начин. Вкрстувањата на соеви изолирани од компири со соеви од домати дадоа најголем број на ооспори - 0 на квадратни mm. средина (со опсег од 1-2002) и среден процент на ртење на оспорите (13,8 со опсег од 5-19). Вкрстувањата на соеви изолирани од доматот произведоа најмал процент на ооспори (6,3 со опсег од 0-24) со највисок процент на ртење (7,6). Вкрстувањата помеѓу соеви изолирани од компири дадоа среден број на ооспори (4 со висок опсег на податоци - 12-10,8) и најмал процент на ртење на ооспорите (8,6). Така, видовите на компири се помалку плодни од соеви на домати, но меѓупопулациските вкрстувања не дадоа полоши резултати од оние во интрапопулацијата. Можеби разликите со горенаведените податоци од Багирова и сор. се објаснуваат со фактот дека руските истражувачи работеле со соеви изолирани во раните 0-ти години на дваесеттиот век, а швајцарските истражувачи работеле со соеви изолирани во доцните 30-ти.
Ниската плодност може да се заснова на хетероплоидни соеви. Ако кај мексиканските популации, каде што сексуалниот процес и примарната инфекција со ооспорични потомци се редовни, повеќето од проучуваните соеви на P. infestans се диплоидни, тогаш во земјите од Стариот свет е забележан интрапопулациски полиморфизам на плоидија (ди-, три- и тетраплоидни соеви, како и хетерокариотски соеви со хетероплоидни јадра), и соеви кои имаат различни типови на парење, т.е. меѓусебно плодни, се разликуваат во нуклеарната плоидија (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch и Daggett, 1995). Хетероплоидијата на јадрата во антеридија и оогонија може да биде причина за ниска плодност.
Што се однесува до нуклеарната размена помеѓу хифите за време на анастомозите, тоа е спречено со вегетативна некомпатибилност, која ги дели асексуалните популации на многу генетски изолирани клонови (Poedinok и Dyakov, 1987; Gorbunova et al., 1989; Anikina et al., 1997b).
7) Конвергенција на населението. Горенаведените податоци укажуваат дека е можна хибридизација помеѓу соевите „компир“ и „домат“ на P. infestans. Можна е и реципрочна повторна инфекција на различни домаќини, иако со намалена агресивност.
Студијата за популационите маркери во изолатите од соседните полиња со компири и домати во 1993 година покажа дека приближно една четвртина од изолатите изолирани од лисјата од домати биле пренесени од соседното поле со компир (Долгова и сор., 1997). Теоретски, може да се претпостави дека дивергенцијата на популациите на два домаќини ќе се зголеми и ќе доведе до појава на интраспецифични специјализирани форми (f.sp. компир и f.sp. домат), особено затоа што ооспорите можат да се зачуваат во растителните остатоци (Drenth et al., 1995, Багирова, Дјаков, 1998) и семиња од домати (Рубин и сор., 2001). Следствено, доматите моментално имаат извор на пролетно обновување независно од клубени од компири.
Сепак, сè се случи поинаку. Презимувањето со ооспори му овозможи на паразитот да ја избегне најтесната фаза во неговиот животен циклус - моноцикличната фаза на вегетација во почвата, при која паразитските својства се намалуваат, постепено закрепнувајќи се во лето во полицикличната фаза.
Табела 11. Фреквенции на вирулентни гени за сорти на компири во соеви на P. infestans
Земја | Година | Просечен број на вирулентни гени во соеви | Автор | |
од компири | од домат | |||
Франција | 1995 | 4.4 | 3.3 | Лебертон и сор., 1999 г |
1996 | 4.8 | 3.6 | Лебертон, Андривон, 1998 година | |
Франција, Швајцарија | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Кнапова, Гиси, 2002 г |
САД | 1989-94 | 5 | 4.8 | Гудвин и сор., 1995 година |
САД, Западен Вашингтон | 1996 | 4.6 | 5 | Доренс и сор., 1999 г |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Еквадор | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Ојарзун и сор., 1998 г |
Израел | 1998 | 7 | 4.8 | Коен, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Русија, Москва регион | 1993 | 8.9 | 6.7 | Смирнов, 1996 година |
Русија, различни региони | 1995 | 9.4 | 8 | Козловскаја и сор. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Примарните зооспорангии и зооспорите со кои ртат ооспорите имаат висок степен на паразитска активност, особено ако ооспорите се формирани партеногенетски под влијание на феромони од сој со спротивен тип на парење. Затоа, заразниот материјал на садници од домати одгледувани од семиња инфицирани со ооспори е многу патоген и за доматот и за компирот.
Овие промени доведоа до друго преструктуирање на населението, изразено во следните промени кои беа важни од епидемиолошка гледна точка:
- Заразените садници од домати станаа важен извор на примарна инфекција на компирот (Филипов, Ивањук, лични комуникации).
- Епифитотите на компирите почнаа да се забележуваат веќе во јуни, околу еден месец порано од вообичаеното.
- Во насадите на компири, процентот на расата Т1, која претходно се наоѓала таму во мали количини, е зголемен (Уланова и сор., 2003).
- Вирусите изолирани од лисјата на доматот повеќе не се разликуваа од соеви на компир во вирулентноста на диференцијаторите на компирот на вирулентните гени и почнаа да ги надминуваат соевите на „компир“ во агресивност не само на доматот, туку и на компирот (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Така, наместо дивергенција, дојде до конвергенција на популацијата, со појава на една популација на две растенија домаќини со висока вирулентност и агресивност кон двата вида.
Заклучок
Значи, и покрај повеќе од 150 години интензивно проучување на P. infestans, многу останува непознато во биологијата, вклучително и популационата биологија на овој предизвикувачки агенс на најважните болести на култивираните растенија ноќни шипки. Не е јасно како поминувањето на одделните фази од животниот циклус влијае на структурата на популациите, кои се генетските механизми на канализирана варијабилност на агресивноста и вирулентноста, каква е врската помеѓу сексуалните и клоналните репродуктивни системи кај природните популации, како вегетативната некомпатибилност се наследува, каква е улогата на компирот и доматот во примарната инфекција на овие култури и какво е нивното влијание врз структурата на популациите на паразити. Прашањата кои се важни за практични активности, како што се генетските механизми на промени во агресивноста на паразитот или ерозијата на неспецифичната отпорност на компирот, сè уште не се решени. Како што се продлабочуваат и прошируваат истражувањата за доцната болест на компирот, паразитот поставува нови предизвици за истражувачите. Сепак, подобрувањето на експерименталните способности и појавата на нови методолошки пристапи за манипулирање со гените и протеините ни овозможуваат да се надеваме на успешно решение за покренатите прашања.
Написот е објавен во списанието „Заштита на компир“ (бр. 3, 2017 година)