Д. Ју Рјазанцев, Е. М. Чудинова, Л. Ју Кокаева, С. Н. Елански, П. Н. Балабко, Г. Л.
Фитопатогената габа Colletotrichum coccodes предизвикува опасни болести на компирите и доматите, познати како антракоза и црна дамка од клубенот. Врз основа на морфолошките карактеристики, тие често е тешко да се разликуваат од болестите предизвикани од други микроорганизми; На овошјето од зелен домат, болеста може да биде асимптоматска, се појавува само на зрели црвени плодови. За брза и точна дијагноза на патогенот, се нуди PCR тест систем во реално време. За да се развие систем за тестирање, нуклеотидната секвенца на генот на глицерол трифосфат дехидрогеназа беше одредена за 45 соеви на C. coccodes изолирани од клубени од компири во различни региони на Русија.
Врз основа на добиените резултати и анализа на слични секвенци на други видови достапни во базата на податоци на GenBank, специфичните прајмери и сонда беа дизајнирани за C. coccodes. За да се провери специфичноста на креираниот систем за тестирање, беше изведена PCR со ДНК изолирана од чисти култури на 15 различни видови паразитски и сапротрофни габи поврзани со растенија од домати и компир (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani , Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsisphaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Присуството на Colletotrichum coccodes DNA беше откриено на праг циклус од 20-27, додека другите видови беа откриени по 40 циклуси или не беа откриени. Системот за тестирање ви овозможува со сигурност да откриете концентрации на ДНК на C. coccodes што надминуваат 0.01 ng/mm3 во анализираната ПЦР смеса. Користејќи го развиениот тест систем, беше проучено присуството на C. coccodes во лисјата од домати со симптоми на габични заболувања и во клубени од компир без надворешни симптоми на болеста. Лисја со симптоми на габична инфекција беа собрани од две различни полиња во регионот Краснодар, клубени - од полиња во регионите Кострома, Москва, Калуга и Нижни Новгород. Во Краснодарскиот регион, пронајден е еден лист од домати со ДНК на C. coccodes; доверливото присуство на ДНК на овој патоген е откриено во 5 примероци на клубени одгледувани во регионите Кострома, Москва и Калуга.
Вовед
Габите од родот Colletotrichum се опасни фитопатогени кои ги напаѓаат житарките, зеленчукот, билките и повеќегодишните овошни и бобинки растенија. Еден од сеприсутните видови од овој род, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Хјуз е предизвикувачки агенс на антракоза и црна дамка на компирот и доматот, а предизвикува болести и на голем број други растенија од семејството на ноќните шипки, вкл. плевел (Dillard, 1992). C. coccodes ги инфицира сите подземни делови на растението, основите на стеблото, лисјата и плодовите (Andrivon et al., 1998; Џонсон, 1994). На кожата на заразените клубени од компир се забележува развој на сиви дамки со нејасно дефинирани рабови, на кои јасно се гледаат црни дамки на спорулација и микросклеротија. За време на складирањето, во пулпата на клубенот може да се формираат чирови со омекната содржина, т.е. болеста влегува во фазата на антракоза, која, сепак, е исклучително ретка.
Во исто време, симптомите на антракоза (чиреви покриени со кожа со мали црни точки) се типични за плодовите од домати. На листовите, симптомите на лезии на C. coccodes се појавуваат како темно кафени дамки, обично граничи со жолто ткиво (Џонсон, 1994).
Развојот на црни дамки на клубени го расипува нивниот изглед, што е особено изразено кога се продаваат измиени компири со црвена кожа. Одвојувањето на лушпата доведува до прекумерно испарување и зголемени загуби на складирање (Hunger и McIntyre, 1979). Оштетувањето на другите растителни органи доведува до загуби на принос, што беше забележано и во отворени и во затворени услови на земја (Џонсон, 1994; Tsror et al., 1999). Болестите предизвикани од C. coccodes се вообичаени во речиси сите региони во светот што произведуваат компир, вклучувајќи ја и Русија (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Контролата на овие болести е тешка поради недоволната ефикасност на постоечките фунгициди против C. coccodes и недостатокот на отпорни сорти (Read and Hide, 1995).
Инокулумот на C. coccodes може да се зачува во клубени од семиња (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), семки од домати (Ben-Daniel et al., 2010) и да преживее долго време во почвата и на растителните остатоци (Дилард, 1990; Дилард и Коб, 1993) и во плевелите (Raid и Pennypacker, 1987). Делата на голем број автори (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) покажаа дека развојот на болеста кај компирите и доматите во голема мера зависи од присуството на инокулум во семенскиот материјал и во почвата. Затоа, за да се минимизираат загубите од болеста, неопходно е да се дијагностицираат (вклучувајќи квантитативни) габични пропагули во семенскиот материјал, во почвата, во клубени од семе од компир и семиња од домати складирани за складирање. Морфолошката дијагностика во почвата и растителниот материјал може да се спроведе само со присуство на микросклеротии, кои, сепак, се наоѓаат и кај други видови габи.
Симптомите на клубени се многу слични на сребрената краста, предизвикана од габата Helminthosporium solani. Изолирањето на Colletotrichum coccodes и Helminthosporium solani во чиста култура е доста тешко и трае долго време поради бавниот раст на хранлива средина. За брзо идентификување на кокоди Colletotrichum, неопходно е да се користат инструментални дијагностички методи. Најпогоден метод е полимераза верижна реакција (PCR) и нејзина модификација - PCR во реално време. Во моментов, во Европа и САД, се користи тест систем развиен од англиски истражувачи (Cullen et al., 2002) за ITS1 регионот на rDNA. Неговата употреба, исто така, покажа добри резултати во анализата на руските изолати (Belov et al, 2018). Сепак, C. coccodes е многу променлив и неговото откривање со користење на една ДНК секвенца може да доведе до лажно негативни резултати. За поголема дијагностичка веродостојност, потребна е анализа на неколку секвенци на ДНК специфични за видовите, и затоа развивме оригинален тест систем кој ни овозможува да ги идентификуваме C. coccodes според низата на генот на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа.
материјали и методи
За да се процени ефективноста и специфичноста на креираните системи за тестирање, користени се чисти култури на 15 видови габи изолирани од авторите од погодените примероци на лисја и плодови од домати и клубени од компири (Табела 1). За изолација, земени се растителни органи со симптоми на габична инфекција, не повеќе од еден орган по грмушка.
Дел од клубенот со кора, парче овошје од домати или засегнат лист беа ставени под бинокуларен микроскоп, по што мицелиумот, спорите или парче ткиво беа префрлени во агарска средина (кантарион агар) во петриева чинија. со остро изострена игла за расчленување. Изолатите беа складирани на косини на агар во епрувети на 4°C.
Примероците од листовите од доматот наменети за анализа со симптоми на габични заболувања веднаш по собирањето (на терен) беа ставени во 70% етил алкохол во кој се чуваа до екстракција на ДНК. Клубените од компири беа доставени во лабораторија, излупени (парче 2 × 1 cm) и замрзнати на -20°C. Тие беа чувани замрзнати до екстракција на ДНК.
Чисти култури на габи за екстракција на ДНК беа одгледувани во течен медиум за грашок. Габичниот мицелиум беше отстранет од течната средина, сушена на филтер-хартија, замрзната во течен азот, хомогенизирана, инкубирана во CTAB пуфер, прочистена со хлороформ, таложена со мешавина од изопропанол и 0.5 М калиум ацетат и измиена двапати со 2% алкохол. . Добиената ДНК беше растворена во дејонизирана вода и складирана на -70°C (Kutuzova et al., 20). Концентрацијата на ДНК беше измерена со помош на комплетот за квантификација на ХС ДНК за двоверижна ДНК на Qubit 2017 (Qiagen, Германија). Зачуваните и замрзнатите примероци беа мелени во течен азот, а потоа ДНК беше изолирана како што е опишано погоре (за мицелиум од чисти габични култури).
Табела 1. Потекло на габични соеви кои се користат во оваа работа
Името на печурката | растение, орган | Место на избор |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | клубенот од компири | Регионот Кострома, клубени од компир од 1-ва полска генерација, сорта Црвен Скарлет |
Кокоди Colletotrichum 4 | лист од компир | Реп. Мари Ел, Јошкар-Ола |
Helminthosporium solani | клубенот од компири | Регионот Магадан, поз. Шатор, клубенот од компири |
Cladosporium fulvum | лист од домати | Московски регион, домати со големи плодови |
Алтернарија томатофила | овошје од домати | пренесени од вработени во лабораторијата за микологија и фитопатологија на Серускиот истражувачки институт за заштита на растенијата |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | овошје од домати | Краснодарскиот регион, Кримската област, сортата Сливка |
Fusarium OxySporum. | корен од пченица | Московскиот регион |
ПЦР беше спроведен со помош на засилувач DTprime (ДНК-технологија). За да извршиме PCR, користевме оригинални прајмери и сонда за специфичниот регион на генот на глицерол трифосфат дехидрогеназа: напреден прајмер Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCACGCA, обратен прајмер Coc280gdr – TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGGTbe (CocTTGAGCATGTAGGCCTGGGGT,pro). AMdT) - GGGCTGCTGCCG(p). Прајмерите засилуваат регион од 1 bp.
Реакцијата вклучува 50 ng вкупна ДНК (при анализа на лисја и клубени) и 10 ng (кога се анализира ДНК од чисти габични култури). Реакционата смеса (35 μl) беше поделена на два дела со парафински слој: долниот (20 μl) содржеше 2 μl 10 × реакционен пуфер (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 мМ MgCl2; горниот содржеше 0.1 μl 20× PCR пуфер и 0.5 единица Taq полимераза.
Одвојувањето на смесата со парафин им овозможува на цевките да се чуваат долго време на температура од 5°C и да се обезбеди топол почеток на PCR откако ќе се загреат 10 минути на температура над 80°C. PCR беше спроведена според следната програма: 94.0°C – 90 s (1 циклус); 94.0°C – 30 s; 64.0°C – 15 s (5 циклуси); 94.0°C – 10 s; 64.0°C – 15 s (45 циклуси); 10.0°C – складирање.
Резултати и дискусија
Секвенците на генот на глицерол трифосфат дехидрогеназа беа утврдени во 45 соеви изолирани од лисја, стебла, клубени од компир и плодови од домати (Кутузова, 2018) во различни региони на Русија. Проучените секвенци на сите соеви беа поделени во 2 групи, кои се разликуваат во два нуклеотиди. Нуклеотидните секвенци на претставниците на двете групи се депонирани во GenBank под броевите KY496634 и KY496635.
Прајмерите coc70gdf, coc280gdr и сондата cocgdz конструирани на нивна основа беа проверени со помош на програмата BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) на сите генски секвенци на глицерол трифосфат дехидрогеназа достапни во базата на податоци на GenBank од видови од родот Colletotrichum и други организми.
Не беа пронајдени ДНК региони на други организми високо хомологни на прајмерите и сондата.
Чувствителноста на системот за тестирање беше тестирана со користење на примероци со различни концентрации на ДНК на C. coccodes, ДНК од лист од компир погоден од антракоза (собран во 2017 година во Мари Ел, сортата Ред Скарлет) и лушпи од клубени погодени од црна дамка (собрана во регионот Кострома, сорта Red Scarlett, табела 2). За да се потврди присуството на ДНК во клубени и лисја од компир, соевите на C. coccodes беа изолирани од нив во чисти култури.
Резултатите од анализата на чувствителноста на системот за тестирање покажуваат дека тој може да се користи за успешно дијагностицирање на присуството на ДНК на C. coccodes во примерокот ако неговата вкупна содржина во мешавината на PCR е повеќе од 0.05 ng. Ова е сосема доволно за откривање, бидејќи една склеротија во просек содржи 0.131 ng, а една спора - околу 0.04 ng ДНК (Кулен и сор., 2002). Системот за тестирање развиен од англиската група (Cullen et al., 2002) покажа слична чувствителност (циклус на праг 34 на 0.05 ng ДНК и 37 на 0.005 ng).
Анализата на природните примероци кои содржат C. coccodes во сите случаи овозможи со сигурност да се открие неговото присуство во примерокот (Табела 2). Предложениот метод за екстракција на ДНК, исто така, се покажа како применлив за анализа на примероци од природни растенија.
Табела 2. Одредување на чувствителноста на предложениот систем за тестирање на Colletotrichum coccodes за идентификација за PCR во реално време
Образец | Количина на ДНК во примерокот*, ng | Циклус на праг | Откривање на C. coccodes |
---|---|---|---|
Мицелиум од Colletotrichum кокоди | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Лушпа од клубени 1 | 50 | 32 | + |
Лушпа од клубени 2 | 50 | 30 | + |
Лушпа од клубени 3 | 50 | 31.5 | + |
лист од компир | 50 | 29.5 | + |
Забелешка. *Во мешавина од PCR производи.
Специфичноста на системот за тестирање беше тестирана на примероци од ДНК извлечени од 15 видови габи. Сите габични соеви беа изолирани од авторите од погодените и здрави плодови и лисја од домати и клубени од компири; еден вид беше изолиран од коренот на пченицата (Табела 1). Меѓу оние кои се изолирани од површината на плодот, има и видови кои не се патогени за доматот (на пример, Phellinus ferrugineovelutinus).
Студиите покажаа дека ДНК на C. coccodes беше откриена на праг циклус од 20-27, додека другите габични видови не беа откриени или дадоа сигнал по циклусот 40, што може да се припише на неспецифичен ефект на бучава (Табела 3).
Табела 3. Испитување на системот за различни видови печурки
Името на печурката | Циклус на праг |
Кокдоти Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. кокоди 2 | 22.6 |
C. кокоди 3 | 23 |
C. кокоди 4 | 22 |
Fusarium OxySporum. | > 40 |
F. verticillium | > 40 |
Ризоктонија солани | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Стемфилиум везикариум | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Кладоспориум кладоспориоиди | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Пеницилин sp. | > 40 |
Забелешка. *Количината на ДНК во сите примероци беше 10 ng.
Развиениот тест систем беше искористен за да се идентификуваат C. coccodes во примероци од лисја од домати со симптоми на оштетување од некротрофни патогени и клубени од семенски компир без видливи симптоми. За студијата, земени се семе клубени од различни сорти одгледувани во регионите Кострома, Москва, Калуга и Нижни Новгород. Присуството на ДНК на C. coccodes се сметаше за сигурно во примероците во кои циклусот на прагот не надминува 35. Оваа прагна вредност беше избрана врз основа на веродостојната детекција на 0.05 ng од ДНК на C. coccodes (циклус на праг 33.5, Табела 2) и фактот дека кога на праговите циклуси над 40, беше дијагностицирана неспецифична ДНК на некои други габични видови. Со овој пристап, доверливото присуство на ДНК на C. coccodes беше откриено во 5 примероци на клубени одгледувани во регионите Кострома, Москва, Калуга и во еден лист од домати од областа Јеиск на Краснодарската територија (Табели 4, 5).
Табела 4. Откривање на Colletotrichum кокоди на клубени од компир*
Број на примерок | Разновидноста на компири | Место на раст | Откривање на C. coccodes | Циклус на праг |
---|---|---|---|---|
1 | Црвен Скарлет | Регионот Кострома | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Санте | Московскиот регион | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky рано | Московскиот регион | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Моли | Калуга регионот. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Фантазија | Калуга регионот. | - | |
15 | Гала | Нижни Новгород регионот. | - | |
16 | - |
Забелешка. *Количината на ДНК во сите примероци беше 50 ng.
Табела 5. Откривање на Colletotrichum coccodes на листови од домати*
Број на примерок | Место на раст | Откривање на C. coccodes | Циклус на праг |
---|---|---|---|
1 | Краснодарски регион, област Крим | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Краснодарски регион, област Јеиск | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
*Количината на ДНК во сите примероци беше 50 ng.
Системот за тестирање што го создадовме не е инфериорен во однос на оној развиен од англиски истражувачи (Cullen et al., 2002) по чувствителност и специфичност и е погоден за анализа на примероци од растенија. Неговата употреба за анализа на клубени од семиња овозможи да се открие ДНК на C. coccodes во клубени без надворешни знаци на оштетување и успешно да се анализира инфекцијата на лисјата.
Во Русија, до денес, клубени од компир не се анализирани за инфекција со C. coccodes. Нашата прва студија покажа дека од 16 тестирани клубени од семиња одгледувани во различни региони на Руската Федерација, 5 содржат C. coccodes. Ова покажува дека црната дамка на клубени од компир е честа болест на компирот во Русија, а нејзината улога во намалувањето на обемот и квалитетот на културата на компирот е потценета.
При анализа на лисјата од домати, во еден лист од областа Јеиск на Краснодарската територија беше откриено сигурно присуство на ДНК на C. coccodes. Претходно, при испитување на полињата со домати во јужна Русија користејќи британски тест систем (Cullen et al., 2002), беа идентификувани листови кои содржат C. coccodes, а на некои полиња беше пронајден висок процент на лисја погодени од C. coccodes (Belov et al. ал., 2018). Во териториите Краснодар и Приморски и во московскиот регион, откривме плодови од домати, од кои успеавме да изолираме чисти култури на C. coccodes. Можно е C. coccodes да е многу пораспространета на доматите во Русија отколку што се верува во моментов, а неговата штетност исто така е потценета.
Така, до денес се акумулирани доволно информации за широката дистрибуција на C. coccodes на компирите и доматите.
За подобро разбирање на улогата на оваа габа во развојот на болестите на компирот и доматот, неопходно е опширно следење на нејзината распространетост во Русија, проучување на улогата на инфекциите на почвата и семињата и улогата на црната дамка во загубите на складирање. Употребата на PCR дијагностика може значително да ја олесни оваа работа, а истовремената употреба на двата тест системи значително ќе ја зголеми точноста на анализата.
Работата беше поддржана од грант на Руската научна фондација бр. 18-76-00009.
Статијата е објавена во списанието „Микологија и фитопатологија“ (том 54, бр. 1, 2020 година).